Il rapporto primario è davvero l'importanza dello stress di localizzare accuratamente la regione di frequenza specifica della membrana basilare nella maggior parte dei modelli, dove i numeri sinapsi alterati e la funzione possono essere analizzati. La localizzazione cocleare delle regioni di frequenza specifiche viene eseguita in modo affidabile utilizzando mappe di frequenza di posizione in combinazione con i dati del cocleogramma. Il microscopio fornisce informazioni su diversi studi di ricerca.
Supporta l'idea che la neuropatia cocleare sia il principale evento iniziale che precede specificamente la perdita dell'udito, l'acufene e l'iperacusia. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo maschio C57 nero 6J adulto di otto settimane anestetizzato. Posizionare il mouse su un tappetino termico di 37 gradi celsius in una stanza schermata elettricamente e acusticamente.
Quindi, posizionare un elettrodo di registrazione dell'ago subdermico calibro 20 millimetri 28, con la profondità di tre millimetri sotto la pelle al vertice del cranio. Un elettrodo di riferimento nella regione del parotido ipsilaterale, al di sotto dell'apice dell'orecchio misurato e un elettrodo di terra nella regione parotidica conlaterale. Posizionare un altoparlante a campo chiuso dotato di un tubo di plastica di due centimetri con una punta a forma di cono accanto al mouse e inserire la punta nel condotto uditivo esterno.
Per una risposta uditivo al tronco encefalico, o registrazione ABR, generare pip di tono a livelli di pressione sonora decrescente da 90 a 10 decibel, in passaggi del livello di pressione sonora da cinque a 10 decibel. Durante questo passaggio, le risposte vengono amplificate, filtrate e mediate. Ad ogni frequenza, determinare la soglia ABR, che è il livello minimo di pressione sonora che si traduce in una registrazione ABR affidabile con una o più onde distinguibili che possono essere chiaramente identificate dall'ispezione visiva.
Dopo la registrazione ABR, esporre il bulla dal lato ventrale e aprire il bulla con forbici affilate per ottenere l'accesso alla cochlea. Usando forcep fini, rimuovere le ossa temporali e retare l'arteria delle stapes. Quindi rimuovere le staffe dalla finestra ovale e rompere la membrana della finestra rotonda.
Ruotare delicatamente la punta di un ago calibro 27 di 13 millimetri per fare un piccolo foro all'apice della cochlea, prima di utilizzare una pipetta a punta fine per sciacquare delicatamente la paraformaldeide del 4% attraverso la finestra negli spazi perilimphatici. Quindi, sciacquare le ossa tre volte per cinque minuti per lavaggio con PBS molare fresco freddo 0,1 per lavaggio. Seguito dalla decalcificazione delle ossa con 10%EDTA per quattro ore a temperatura ambiente e 20 rotazioni al minuto su uno shaker orizzontale.
Al termine dell'incubazione, trasferire un osso temporale decalcificato in PBS molare fresco 0,1 al microscopio sezionato. Utilizzare 3 e 5 pini Dumont e un ago calibro 27 per sezionare le regioni apicali, centrali e basali della coclea a turno. Utilizzare una lama di rasoio per effettuare una piccola serie di tagli lungo il legamento a spirale e rimuovere la membrana tectoriale e la membrana di Reissner.
Sezionare ulteriormente l'epitelio uditivo rimanente, incluso il limbo a spirale, in singole curve cocleari per preparati a montaggio intero. Quindi utilizzare l'obiettivo dell'olio 40X di un microscopio leggero per misurare la lunghezza della membrana basilare con scala di 250 micrometri posizionata nell'oculare. Può essere regolato lungo la stereocilia delle cellule ciliate interne.
Dopo la dissezione, posizionare ogni cocleare trasformarsi in singoli tubi di centrifuga da 2,5 millilitri. Bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra al 10% in PBS nello 0,1%Triton X-100 per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore. Al termine dell'incubazione, utilizzare la punta della pipetta da 200 microliter per rimuovere la soluzione al microscopio a dissezione.
Incubare i campioni con gli anticorpi primari di interesse diluiti nel siero di capra al 5% e PBS nello 0,1%Tritone X-100 durante la notte a 4 gradi Celsius su un rotatore. La mattina successiva, sciacquare i campioni di tessuto tre volte per cinque minuti con PBS molare freddo 0,1 per lavaggio per rimuovere eventuali anticorpi primari residui. Etichettare quindi i campioni con gli anticorpi secondari appropriati diluiti nel siero di capra al 5% in PBS nello 0,1%Tritone X-100 per due o tre ore a temperatura ambiente sul rotatore, protetto dalla luce.
Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte con PBS molare 0,1 come dimostrato e trasferire i campioni in singole piastre da 35 millimetri contenenti 0,1 PBS molare. Posizionare una goccia di supporto di montaggio integrato DAPI sullo scivolo e trasferire i campioni dal PBS al mezzo di montaggio. Posizionare un bordo di un coperchio scivolare su ogni diapositiva e rilasciare per lasciare che il coperchio scivoli delicatamente.
Quindi asciugare le diapositive in una casella di scorrimento a quattro gradi Celsius durante la notte. Per immaginire i campioni, utilizzare un microscopio confocale con i laser appropriati e l'obiettivo ad immersione dell'olio ad alta risoluzione 63X per acquisire otto pile Z confocali micrometriche da ogni giro cocleare. Per i conteggi di puncta sinaptici, impostare le pile Z con la dimensione del passo di 0,3 micrometri per coprire l'intera lunghezza delle cellule ciliate interne, assicurando che tutta la puncta sinaptica possa essere imageizzata e unire la puncta contenente immagini in una pila Z per ottenere la proiezione di accesso Z.
Importare le immagini unite in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato. Dividi i conteggi totali sinaptici in ogni pila Z in specifiche regioni di frequenza per il numero di cellule ciliate interne positive DAPI per calcolare il numero di puncta sinaptici per ogni cellula. Ad ogni specifica regione di frequenza, media tutta la puncta sinaptica in tre immagini di diversi campi microscopici, contenente da nove a 11 cellule ciliate interne.
Per visualizzare meglio l'architettura citoscheletricha e la localizzazione sinaptica, utilizzare lo strumento pennello per valutare visivamente la struttura sinaptica e la distribuzione delle singole cellule ciliate interne. Per ispezionare la giustapposizione di nastri setnaptici e patch del recettore postsinaptico, utilizzare lo strumento tendone rettangolare estrarre lo spazio voxel intorno ai nastri e utilizzare il taglio delle immagini per isolare i singoli nastri. Quindi fare clic sulle dimensioni dell'immagine e dell'immagine per acquisire una matrice di miniature di queste proiezioni in miniatura che possono essere utilizzate per identificare le sinapsi accoppiate rispetto alle barre multifunzione orfane.
Tutti e dieci i topi in questo esperimento rappresentativo hanno mostrato soglie ABR in risposta a raffiche di tono che vanno da 25 a 70 decibel per livello di pressione sonora a seconda della frequenza dello stimolo. La soglia uditrice per questo esperimento era più bassa a 16 kilohertz corrispondente a circa il 43% della distanza dall'apice cocleare, suggerendo che la sensibilità acustica è significativamente ridotta in altre regioni cocleari. Interi supporti dell'epitelio uditivo sono sezionati in tre pezzi e le lunghezze vengono misurate e convertite nella loro distanza percentuale dall'apice cocleare.
La posizione di frequenza sulla membrana basilare di ogni giro cocleare viene calcolata utilizzando la funzione logaritmica. Nelle orecchie normali dei topi adulti, l'immunostaining rivela coppie giustapposti di nastri sinaptici e cerotti del recettore del glutammato. Studio della superficie della membrana basolaterale delle cellule ciliate interne, con da otto a 20 paia per cellula.
Sebbene la stragrande maggioranza dei puncta appaia come coppie giustapposti nelle orecchie normali, i nastri orfani sono raramente osservati ad alti ingrandimenti. Il numero di sinapsi interne del nastro dei capelli è più alto nella regione di 16 kilohertz e diminuisce significativamente con l'aumentare della distanza da questa posizione. La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che si deve garantire l'integrità della membrana basale cocleare.
Dobbiamo sottolineare l'accuratezza fino a quando non si raggiungerà la competenza tecnica. Seguendo questa procedura, la terapia genica può essere eseguita per rispondere se la neuropatia cocleare può essere riparata da questa misura. Questa misura è una tecnica più ampia per esplorare la neuropatia cocleare, che se gli eventi iniziali primari si associano ad avere perdita dell'udito, acufene e iperacusia.
