הדו"ח העיקרי הוא באמת להדגיש את החשיבות של איתור מדויק של אזור התדירות הספציפית של קרום הבזיליקום ברוב המודלים, שבו מספרי הסינפסה השתנו ותפקוד ניתן לנתח. לוקליזציה שברוך של אזורי התדרים הספציפיים מבוצעת באופן אמין באמצעות, למקם מפות תדירות בשילוב עם נתוני שבך. המיקרוסקופ מספק תובנה למספר מחקרים.
זה תומך ברעיון כי נוירופתיה שברוך הוא האירועים הראשוניים העיקריים במיוחד לפני אובדן שמיעה, טינטון, hyperacusis. לאחר שאישר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר מבוגר מבוגר בן שמונה שבועות C57 שחור 6J. מניחים את העכבר על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס בחדר מוגן חשמלית ואקוסטית.
לאחר מכן, מניחים תת עורי 20 מילימטר 28 מד מחט הקלטת אלקטרודה, עם עומק של שלושה מילימטרים מתחת לעור בקודקוד של הגולגולת. אלקטרודה התייחסות באזור parotid ipsilateral, מתחת לפינה של האוזן נמדד אלקטרודה הקרקע באזור פרוטיד contralateral. מניחים רמקול שדה סגור המצויד בצינור פלסטיק באורך שני ס"מ עם קצה בצורת חרוט ליד העכבר ומתאימים את הקצה לתעלת האוזן החיצונית.
עבור תגובת גזע מוח שמיעתי, או הקלטת ABR, ליצור פיפס צליל בהפחתת רמות לחץ הקול מ 90 עד 10 דציבלים, ב 5 עד 10 צעדים ברמת לחץ קול דציבלים. במהלך שלב זה, התגובות מוגברות, מסוננים וממוצעים. בכל תדר, לקבוע את סף ABR, שהוא רמת לחץ הקול המינימלי שתוותה הקלטת ABR אמינה עם גל אחד או יותר להבחין שניתן לזהות בבירור על ידי בדיקה חזותית.
לאחר הקלטת ABR, לחשוף את הבולה מהצד הגחון ולפתוח את הבולה עם מספריים חדים כדי לקבל גישה cochlea. באמצעות מטלפים עדין, להסיר את עצמות הזמן ולנתק את עורק stapes. לאחר מכן הסר את stapes מהחלון הסגלגל ולקרוע את קרום החלון העגול.
סובב בעדינות את קצה מחט מד 13 מילימטר 27 כדי לעשות חור קטן על פסוק של cochlea, לפני השימוש פיפטה הטה בסדר לשטוף בעדינות 4% paraformaldehyde דרך החלון לתוך החללים perilymphatic. לאחר מכן, לשטוף את העצמות שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף עם קר טרי 0.1 PBS טוחן לכל לשטוף. ואחריו מדבקה של העצמות עם 10% EDTA במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר ו 20 סיבובים לדקה על שייקר אופקי.
בסוף הדגירה, מעבירים עצם זמנית מדבקת ל-PBS רענן 0.1 טוחן תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש 3 ו 5 מדפים Dumont ומחט מד 27 לנתח את אזורי שבלול אפי, אמצע, ובזלת בתורו. השתמש בסכין גילוח כדי לבצע סדרה קטנה של חתכים לאורך הרצועה הספירלית ולהסיר קרום tectorial ואת הממברנה של רייסנר.
עוד לנתח את האפיתל השמיעתי הנותר, כולל לימבוס ספירלי, לתוך שרוך בודדים פונה להכנות הר שלם. לאחר מכן השתמש במטרה שמן 40X של מיקרוסקופ אור כדי למדוד את אורך קרום הבזיליקום עם סולם 250 מיקרומטר ממוקם בחתיכת העין. זה יכול להיות מותאם לאורך stereocilia של תאי השיער הפנימיים.
לאחר הניתוח, מניחים כל שרוך הופכים לצינורות צנטריפוגה בודדים של 2.5 מיליליטר. חסום כל כריכה לא ספציפית עם סרום עיזים 10% ב- PBS ב- 0.1% טריטון X-100 למשך שעה בטמפרטורת החדר על מסובב. בסוף הדגירה, השתמש 200 טיפ פיפטה microliter כדי להסיר את הפתרון תחת מיקרוסקופ ניתוח.
הדגירה את הדגימות עם הנוגדנים העיקריים של עניין מדולל 5% סרום עזים PBS ב 0.1% טריטון X-100 לילה ב 4 מעלות צלזיוס על מסובב. למחרת בבוקר, לשטוף את דגימות הרקמה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם קר 0.1 PBS טוחן לכל לשטוף כדי להסיר כל נוגדן ראשוני שיורית. לאחר מכן תייג את הדגימות בנוגדנים המשניים המתאימים מדוללים בסרום עיזים 5% ב- PBS ב- 0.1% טריטון X-100 למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר על המסובב, מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 0.1 PBS טוחן כפי שהוכח ולהעביר את הדגימות לתוך צלחות בודדות 35 מילימטר המכיל 0.1 PBS טוחן. מקם טיפה של אמצעי הרכבה בתוספת DAPI על השקופית והעבר את הדגימות מ- PBS למדיום ההרכבה. מניחים קצה אחד של החלקת כיסוי על כל שקופית ומשחררים כדי לאפשר לתלשולי הכיסוי ליפול בעדינות.
ואז לייבש את השקופיות בתיבת שקופיות בארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי לדמיין את הדגימות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים ועדשת טבילת שמן ברזולוציה גבוהה פי 63 כדי לרכוש שמונה ערימות קונפוקל Z מיקרומטר מכל סיבוב בשבך. לספירת נקודות סינפטית, קבעו את ערימות ה-Z בגודל של 0.3 מיקרומטר כדי להתפרס על כל אורך תאי השיער הפנימיים, וערכו את כל הנקב הסינפטי שניתן יהיה לדמיין ולמזג את הנקב המכיל תמונות בערימה Z כדי לקבל את הקרנת הגישה Z.
יבא את התמונות הממוזגות לתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. חלק את הספירות הכוללות הסינפטיות בכל מחסנית Z באזורי תדירות ספציפיים במספר תאי השיער הפנימיים החיוביים של DAPI כדי לחשב את מספר הנקב הסינפטי עבור כל תא. בכל אזור תדר ספציפי, ממוצע כל puncta סינפטית בשלוש תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים, המכיל תשעה עד 11 תאי שיער פנימיים.
כדי להמחיש טוב יותר את הארכיטקטורה הציטוסקלטלית ואת לוקליזציה סינפטית, השתמש בכלי המברשת כדי להעריך באופן חזותי את המבנה הסינפטי ואת ההפצה של תאי השיער הפנימיים הבודדים. כדי לבדוק את ההקפדה על סרטים פרה-סינפטיים ותיקונים של קולטן פוסט-סינפטי, השתמש בכלי כתובית מלבנית כדי לחלץ את שטח הווקסל סביב הסרטים ולהשתמש בחיתוך תמונות כדי לבודד את הסרטים הבודדים. לאחר מכן לחץ על גודל תמונה ותמונה כדי לרכוש מערך תמונות ממוזערות של הקרנות זעירות אלה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות סינפסות משוכות לעומת סרטים יתומים.
כל עשרת העכברים בניסוי מייצג זה הציגו סף ABR בתגובה להתפרצויות טון הנעות בין 25 ל -70 דציבלים לכל רמת לחץ קול בהתאם לתדירות הגירוי. סף השמיעה לניסוי זה היה הנמוך ביותר ב 16 קילוהרץ המתאים כ 43% מהמרחק מן הצוק שבך, מה שמרמז כי הרגישות האקוסטית מופחתת באופן משמעותי באזורים שבקלים אחרים. הרכבים שלמים של האפיתל השמיעתי נותאו לשלושה חלקים והאורך נמדד ומומר למרחק האחוזים שלהם מהפסגת ברכיכה.
מיקום התדר על קרום הבזיליקום של כל סיבוב בשבך מחושב באמצעות פונקציה לוגריתמית. באוזניים רגילות של עכברים בוגרים, immunostaining מגלה זוגות בשילוב של סרטים סינפטיים ותאי קולטן גלוטמט. לימוד פני השטח של קרום הבזלת של תאי השיער הפנימיים, עם שמונה עד 20 זוגות לכל תא.
למרות שהרוב המכריע של הפנצטה מופיעים כזוגות בשילוב באוזניים רגילות, סרטים יתומים נצפים לעתים רחוקות בהגדלות גבוהות. מספר הסינפסות הפנימיות של רצועת הכלים של תאי השיער הוא הגבוה ביותר באזור 16 קילוהרץ ומצטמצם באופן משמעותי ככל שההרחקה ממיקום זה גדלה. הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי יש להבטיח את השלמות של קרום בזל שבליל.
אנחנו צריכים להדגיש את הדיוק עד מיומנות טכנית הוא הגיע. בעקבות הליך זה, הריפוי הגנטי יכול להתבצע כדי לענות אם נוירופתיה cochlear ניתן לתקן על ידי מדד זה. מדד זה הוא טכניקה רחבה יותר לחקר נוירופתיה שבשבך, אשר אם האירועים הראשוניים העיקריים לקשר עם אובדן שמיעה, טינטון, hyperacusis.
