Основной доклад действительно подчеркнуть важность точного определения конкретной частотной области базилярной мембраны в большинстве моделей, где номера синапса изменены и функции могут быть проанализированы. Кохлеарная локализация конкретных частотных областей надежно выполняется с использованием, место частотных карт в сочетании с данными кохлеограммы. Микроскоп дает представление о нескольких научных исследованиях.
Он поддерживает идею о том, что кохлеарная невропатия является основным первоначальным событиям, специально предшествующим потере слуха, шуму в ушах и гиперакусии. После подтверждения отсутствия ответа на боль в крайнем случае в анестезировали восемь недель взрослый C57 черный 6J мужской мыши. Поместите мышь на тепловую площадку 37 градусов по Цельсию в электрически и акустически защищенную комнату.
Далее поместите поддермальный 20 миллиметров 28 калибровочный электрод записи иглы, с глубиной три миллиметра под кожей на вершине черепа. Эталонный электрод в ипсилатеральной околоушной области, ниже пинды измеренного уха и наземного электрода в контралатеральной околоушной области. Поместите закрытый полевой динамик, оснащенный двухметровой пластиковой трубкой с наконечником конусообразной формы рядом с мышью, и поместите кончик во внешний ушной канал.
Для слуховой реакции ствола мозга, или записи ABR, генерировать сигнал пипсов при снижении уровня звукового давления от 90 до 10 децибел, в 5 до 10 децибел звуковой уровень давления шаги. Во время этого шага ответы усиливаются, фильтруются и усредоваются. На каждой частоте определите порог ABR, который является минимальным уровнем звукового давления, что приводит к надежной записи ABR с одной или более различимыми волнами, которые могут быть четко определены визуальным осмотром.
После записи ABR, разоблачить буллу с брюшной стороны и открыть буллу острыми ножницами, чтобы получить доступ к улитке. Используя тонкие типсы, удалить височные кости и разорвать стенок артерии. Затем удалите стапы из овального окна и разорвете круглую оконную мембрану.
Аккуратно поверните кончик 13-миллиметровой 27 калибровочной иглы, чтобы сделать небольшое отверстие на вершине улитки, прежде чем использовать тонкую наконечником пипетку, чтобы аккуратно промыть 4%paraformaldehyde через окно в перилимфатические пространства. Затем, промыть кости три раза в течение пяти минут за стирку с холодной свежей 0,1 молара PBS за стирку. Затем наклейка костей с 10%EDTA в течение четырех часов при комнатной температуре и 20 вращений в минуту на горизонтальном шейкере.
В конце инкубации перенесите десятиквеченную височную кость в свежую 0,1 молярного PBS под рассеченным микроскопом. Используйте 3 и 5 типсов Дюмона и 27 калибровочных игл для вскрытия апиальных, средних и базальных областей улитки в свою очередь. Используйте лезвие бритвы, чтобы сделать небольшую серию порезов вдоль спиральной связки и удалить текторильную мембрану и мембрану Рейсснера.
Далее вскрыть оставшийся слуховой эпителий, в том числе спиральный лимбус, в отдельных кохлеарных поворотов для целых препаратов горе. Затем используйте 40X масляную цель светового микроскопа для измерения длины базилярной мембраны с 250 микрометровой шкалой, помещенной в кусок глаза. Его можно регулировать вдоль стереоцилии внутренних волосковых клеток.
После вскрытия поместите каждый кохлеарный поворот в отдельные 2,5 миллилитровые центрифуги труб. Блокируйте любую неспецифическую привязку с сывороткой 10%козы в PBS в 0.1%Triton X-100 в течение одного часа при комнатной температуре на ротаторе. В конце инкубации используйте наконечник пипетки из микролитров, чтобы удалить раствор под микроскопом вскрытия.
Инкубировать образцы с первичными антителами интереса разбавленной в 5%goat сыворотки и PBS в 0.1%Triton X-100 ночь при 4 градусах по Цельсию на ротатор. На следующее утро, промыть образцы тканей три раза в течение пяти минут с холодной 0,1 молара PBS за стирку, чтобы удалить любые остаточные первичные антитела. Затем маркировать образцы соответствующими вторичными антителами, разбавленными в сыворотке 5%goat в PBS в 0.1%Triton X-100 в течение двух-трех часов при комнатной температуре на ротаторе, защищенном от света.
В конце инкубации, мыть образцы три раза с 0,1 молярных PBS, как попродемонстрировано, и передать образцы в отдельных 35 миллиметров пластин, содержащих 0,1 моляра PBS. Поместите каплю DAPI дополненной монтажной среды на слайд и перенесите образцы из PBS в монтажную среду. Поместите один край крышки скольжения на каждом слайде и отпустите, чтобы крышка скользит падать мягко.
Затем высушите слайды в слайд-коробке при четырех градусах по Цельсию на ночь. Для изображения образцов используйте конфокальный микроскоп с соответствующими лазерами и 63X высоким разрешением масляного погружения объектив, чтобы приобрести восемь микрометровых конфокальных стеков с каждого кохлеарного поворота. Для синаптических пунктуа рассчитывает, установить стеки с размером шага 0,3 микрометра, чтобы охватить всю длину внутренних волосковых клеток, страхование всех синаптических puncta могут быть изображены и объединить puncta содержащие изображения в стеке, чтобы получить проекцию доступа.
Импортировать объединенные изображения в соответствующую программу обработки изображений. Разделите общее количество синаптических элементов в каждом стеке на определенных частотных регионах на количество положительных внутренних волосковых клеток DAPI для расчета количества синаптической панкты для каждой клетки. В каждой конкретной области частоты, в среднем все синаптические puncta в трех изображениях различных микроскопических полей, содержащих от девяти до 11 внутренних волосковых клеток.
Чтобы лучше визуализировать цитоскелетную архитектуру и синаптической локализации, используйте инструмент кисти для визуальной оценки синаптической структуры и распределения отдельных внутренних волосковых клеток. Для проверки сопоставления пресинаптических лент и постсинаптических рецепторов патчи, использовать прямоугольный инструмент шатер извлечь voxel пространство вокруг лент и использовать изображение резки изолировать отдельные ленты. Затем нажмите изображение и размер изображения, чтобы приобрести эскиз массив этих миниатюрных проекций, которые могут быть использованы для идентификации парных синапсов по сравнению с орфанными лентами.
Все десять мышей в этом репрезентативном эксперименте продемонстрировали пороговые значения ABR в ответ на тонусовые всплески в диапазоне от 25 до 70 децибел на уровень звукового давления в зависимости от частоты стимула. Порог слуха в ходе этого эксперимента был самым низким и составил 16 килогерц, что соответствует примерно 43% расстояния от кохлеарный верх, что свидетельствует о значительном снижении акустической чувствительности в других кохлеарных регионах. Целые крепления слухового эпителия рассекают на три части, а длины измеряются и преобразуются в их процентное расстояние от кохлеарный верх.
Расположение частоты на базилярной мембране каждого кохлеарного поворота рассчитывается с использованием логаритмической функции. В нормальных ушах взрослых мышей, иммуностепенирование показывает сопоставление пар синаптических лент и глутаматных рецепторов патчи. Изучение поверхности базолатеральной мембраны внутренних волосковых клеток, с 8 до 20 пар на клетку.
Хотя подавляющее большинство puncta появляются как сопоставленные пары в нормальных ушах, сирот ленты нечасто наблюдается при высоких увеличений. Количество внутренних волосяных клеток ленты синапсов является самым высоким в области 16 килогерц и значительно уменьшается, как расстояние от этого места увеличивается. Самое главное помнить во время этой процедуры является то, что нужно гарантировать целостность кохлеарный базальной мембраны.
Мы должны подчеркнуть точность до тех пор, пока техническое мастерство не будет достигнуто. После этой процедуры, генная терапия может быть выполнена, чтобы ответить, является ли кохлеарная невропатия может быть восстановлена с помощью этой меры. Эта мера является более широкой техникой для изучения кохлеарный невропатии, которые, если основные первоначальные события связаны с потерей слуха, шум в ушах, и hyperacusis.
