يستخدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتعزيز موثوقية نموذج ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد دون استخدام أي معدات خاصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إجراء تجربة الثقافة ثلاثية الأبعاد القابلة للتكرار من خلال التحكم في حالة الثقافة الأولية داخل الجهاز المكعب. بعد إعداد خمسة من خمسة ملليمتر البولي الإطار مكعب، ووضع الإطار على شريحة المبردة مسبقا وصندوق الثلج واستخدام ماصة لإضافة 12 ميكروليتر من 1.5٪ أكاروز مسخ من الوجه العلوي للإطار مكعب إلى السطح السفلي.
نشر agarose للحصول على سطح مستو والسماح للبوليمر لعلاج. استخدم الملاقط لشريحة الإطار إلى حافة الزجاج وتدوير الإطار بحيث يكون الجانب المفتوح مواجهًا لأسفل قبل إعادة وضع الإطار على الشريحة. بعد ملء السطحين التاليين من الإطار مع المزيد من agarose، كما أظهرت للتو، إسقاط agarose في وعاء من وجه مفتوح لتشكيل جدار agarose على الجانبين الرابع والخامس.
لإعداد شكل كتلة خلية أولية حقن مصفوفة الخلية المناسبة لثقافة الخلية من الفائدة في الفضاء ثقافة مكعب هلام الهجين وتعيين قالب صغير ملفقة على المكعب. ثم ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عندما يتم شفاء المصفوفة خارج الخلية، ورفع بعناية من العفن الصغير بحيث لا تتدهور المصفوفة.
وسيتم ملفقة جيب في شكل القالب المطلوب في مصفوفة خارج الخلية. لتحميل الخلايا تركيز تعليق الخلية التجريبية بعد الطرد المركزي في خلية مناسبة المتوسطة ثقافة التجريبية وحقن الخلايا في الجيب داخل مصفوفة خارج الخلية. ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالوقوع في جيب المصفوفة خارج الخلية ، وملء المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة القالب الصغير.
في نهاية الحضانة، ضع المكعب في بئر واحد من 24 بئراً وأضف 100 ميكرولترات من خلية مناسبة متوسطة لثقافة البئر. حقن مصفوفة إضافية خارج الخلية لإغلاق الجيب والعودة المكعب إلى الحاضنة لمدة 25 دقيقة. عندما يتم الشفاء من المصفوفة خارج الخلية قطرة ما يقرب من 10 ميكرولترات من 20 درجة مئوية agarose على السطح العلوي إلى المكعب لإغلاق السطح وعلاج قطرة لمدة 10 إلى 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ثم تغطية المكعب بأكمله مع المتوسطة الطازجة لتعزيز الضغط التناضح لتسهيل نقل التغذية إلى الخلايا داخل المكعب. بالنسبة للتعرف على الشكل ثلاثي الأبعاد غير الباضع بواسطة المراقبة متعددة الاتجاهات، ضع اللوحة على مرحلة المجهر واحصل على صور لكل جانب من المكعب بواسطة مجهري الحقول أو الطور الساطع، باستخدام ملاقط لتدوير خدمة المكعب ليتم تصويرها بين الالتقاطات. للتصوير المناعي من خلال المراقبة متعددة الاتجاهات، أولاً التبخر من البئر الذي يحتوي على المكعب وإصلاح المكعب في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية التثبيت، وغسل المكعب مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل. Impermeabilize المكعب مع 0.5٪ triton x-100 وBBS لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل المكعب ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسيل ، قبل حظر أي ارتباط غير محدد بمصل الماعز ومخزن المناعة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة وفقا لبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة القياسية. ثم صورة جميع الاطراف الستة من المكعب على مجهر الليزر أو الفلورسنت كما أظهرت للتو. في هذه التجربة التمثيلية التصوير متعدد الاتجاهات من مكعبات هلام الهجين، المستزرعة مع الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية العادية، يوضح توليد الأولية أسطواني أو المنشور ثقافة الخلية على شكل المرحلة على النقيض من ذلك وتصوير المناعة الفلورية من الثقافات.
هنا تلطيخ مناعي من الخلايا الظهارية البشرية العادية التي تسيطر عليها في البداية إلى شكل أسطواني في مكعب هلام الهجين، بعد أن يظهر جيل من شجرة الشعب الهوائية. تظهر الفروع العمودي على المحور الأسطواني ، كما يكشف عن ذلك التصوير متعدد الأبعاد. من المهم حقن كثافة عالية من الخلايا في جيب المصفوفة خارج الخلية ، حيث أن الكثافة المنخفضة للخلايا قد تؤدي إلى تدهور جودة الخلايا بعد الحضانة.
هذا النمط الأسلوب هو تشكيل تكرار لنمط خلوي ثلاثي الأبعاد مع قياس كمي عن طريق التصوير متعدد الاتجاهات لدراسة آلية تطوير الطبق.
