CMOD Pack يسمح لك لنمط الخلايا بدقة عالية جدا والثقافة لهم في 2D أو 3D. وهذا يفتح فرصا لدراسة التفاعلات بين الخلايا الخلية ومورفوجينيسيس الأنسجة الجديدة المحرك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من السهل على المختبرات الأخرى اعتمادها ، فهي لا تتطلب غرفة نظيفة أو معدات متخصصة أو كواشف مخصصة مركبة.
تبدأ بإسقاط قطرات صغيرة من الصورة الإيجابية مقاومة على الشريحة ألدهيد، وذلك باستخدام ماصة المتاح. تدور الشريحة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام مبرمج تدور، ثم وضعه على لوحة ساخنة 100 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة لعبور ربط مقاومة الصورة. قم بإزالة الشريحة من اللوحة الساخنة ووضع قناع صور مع الميزات المطلوبة أعلى الشريحة ، وقم بوزنها بقطعة من الزجاج وقم بتغطية الإعداد بأكمله في صندوق معتم.
فضح الإعداد مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين، وتطوير الشريحة عن طريق غمرها في حل المطور لمدة ثلاث إلى خمس دقائق، ثم شطف بعيدا حل المطور الزائدة بالماء، وتجفيفها تحت تيار من الهواء أو النيتروجين. مراقبة هذا الضوء تحت المجهر لتأكيد نجاح التصوير الحجري وتخزينها في الظلام. إضافة قطرة من 20 ميكرومولار أمين تعديل محلول أوليغوس على كل منطقة منقوشة الصورة من الشريحة ونشر قطرة بلطف في جميع أنحاء المنطقة بأكملها، وذلك باستخدام طرف ماصة، مع الحرص، وليس لخدش الشريحة، خبز الشريحة في فرن 65 درجة مئوية حتى محلول الحمض النووي قد جفت تماما، وإجراء أمين اختزالي عن طريق وضع الشريحة المخبوزة وطبق ثقافة الخلية 15 سنتيمترا في غطاء محرك السيارة الدخان على أعلى من شاكر.
مزيج بلطف 100 ملليغرام من هيدريد بورو الصوديوم في 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وإضافته إلى الطبق. ثم قم بتشغيل شاكر لمدة 15 دقيقة. بعد رد الفعل، اغسل هذه الشريحة مرتين مع كبريتات دودسيل الصوديوم بنسبة 0.1٪ لإزالة الحمض النووي غير المتفاعل.
ثم غسل الشريحة ثلاث مرات بالماء. محرك هذه الشريحة تحت تيار النيتروجين أو الهواء. وأخيرا شطفه مع الأسيتون لإزالة مقاومة الصورة المتبقية.
إعداد أربعة حلول عالمية للمرساة والمحول على النحو المبين في مخطوطة النص وإعداد حل عالمي 20 ميكرومولار مشترك في برنامج تلفزيوني. إعداد تعليق الخلية عن طريق إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS أو وسائل الإعلام الحرة المصل ونقل 1-3 مليون خلية إلى 1.5 ملليلتر مايكرو الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي في 160 مرة G لمدة أربع دقائق.
Resuspend بيليه الخلية التي تم الحصول عليها في 75 ميكرولتر من الجليد البارد PBS أو وسائل الإعلام الحرة المصل وإضافة 75 ميكرولتر من أعدت لمرساة عالمية ميكرومولار ومحول الحل. تخلط جيدا واحتضان لمدة خمس دقائق على الجليد، إضافة 15 ميكرولتر من الحل العالمي المشارك مرساة للأنبوب ومزيج جيدا، ثم احتضان العينة لمدة خمس دقائق على الجليد. لإزالة oligos الزائدة من تعليق الخلية، إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS أو وسائل الإعلام الحرة المصل إلى الأنبوب وخلط مع ماصة.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 160 مرة G لمدة أربع دقائق في أربع درجات مئوية، ثم التخلص من supernatant. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. إعادة إنفاق الخلايا في الجليد كول PBS أو وسائل الإعلام الحرة المصل لإنشاء حل خلية كثيفة من ما لا يقل عن 25 مليون خلية لكل ملليلتر، إمالة قليلا الشريحة نمط، ثم إضافة 25 ميكرولتر من تعليق هذه الخلية إلى مدخل كل خلية تدفق.
قم بإزالة حل PBS و1٪BSA من المنفذ، مما يسمح لتعليق الخلية بملء خلية تدفق PDMs. احتضان على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، يستنشق خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية من منفذ الشريحة وإضافته مرة أخرى إلى المدخل. كرر هذه 10 مرات لكل خلية تدفق.
بلطف ماصة PBS أو وسائل الإعلام المصل الحرة في مدخل كل خلية تدفق لغسل الخلايا الزائدة وجمع تعليق الخلية من منفذ. كرر هذا مرتين إلى أربع مرات حتى لا تبقى أي خلايا زائدة على الشريحة. للثقافة 3D، وإعداد محلول السلائف هلام المائية التي تحتوي على 2٪ DNAs وإضافة 50 ميكرولتر منه إلى مدخل كل خلية تدفق.
يستنشق السائل الزائد من منفذ، مما دفع محلول هيدروجيل في خلية التدفق. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة للسماح للهيدروجلز لتعيين ودق التصاق الحمض النووي القائم بين الخلايا والسطح. إضافة 50 ميكرولتر من هلام هيدرو السلائف إلى بئر من اثنين من الشريحة غرفة بئر أو لوحة بئر ستة.
ماصة 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على جانبي كل خلية تدفق. توزيعه على طول كامل من الخلية تدفق باستخدام شفرة الحلاقة أو العثور على ملاقط نقطة ورفع بلطف جانبي خلايا التدفق بحيث يندفع برنامج تلفزيوني تحت هلام المائية. باستخدام شفرة حلاقة، قم بتحريك خلية التدفق إلى حافة الشريحة عن طريق قلب الشريحة ودفع خلية التدفق من الشريحة بحيث تهبط فوق شفرة الحلاقة.
اختيار خلية تدفق قبالة شفرة الحلاقة باستخدام ملقط منحني. عكس تدفق الخلايا بحيث تكون الخلايا في الجزء السفلي ووضعها على رأس قطرة من محلول هلام هيدرو السلائف. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل بحيث هيدروجيل التي تحتوي على نمط الخلايا يمكن أن ترتبط الأساس الهيدروجيل مما أدى إلى تضمين كامل من الخلايا نمط.
قم بإزالة خلية التدفق وانغمس فيها تماما في الوسائط. دفع بلطف الخلية تدفق باستخدام ملقط منحني حتى الملوثات العضوية الثابتة قبالة ويطفو في وسائل الإعلام، ثم تجاهل ذلك. القياس الكمي لتصاق بقعة الحمض النووي إلى الخلايا المسماة CMO ، مما يزيد.
كدالة لتركيز CMO يتم تمثيله على أنه متوسط الانحراف المعياري عن ثلاث تجارب. وتظهر أنماط الحمض النووي في أرجواني والخلايا CMO التمسك المسمى في سماوي بتركيزات مختلفة من CMO. تظهر هنا مقارنة بين المركبات الهيدروفلورية المسماة CMO والمركبات الهيدروفلورية المسماة بالهوفيكس المسمى بنمط الحمض النووي الخطي.
MDCKs نمط واحد VSC وزارة الدفاع حزمة، ونقلها إلى هلام maitre كانت قادرة على الانتشار والاستقطاب بعد خمسة أيام من الثقافة. تم إنشاء مجاميع متعددة الطبقات متعددة الخلايا بواسطة طبقات متناوبة من الخلايا المسماة بمديرات إدارة المحتوى المجانية. يمكن أن تكون منقوشة مجموعات خلايا فريدة متعددة جنبا إلى جنب مع دقة عالية ودون التلوث المتبادل.
عند محاولة هذا البروتوكول، من الأهمية بمكان أن يكون تعليق الخلايا الكثيفة في حين إضافة الخلايا إلى الشريحة من أجل تعظيم الفرص للخلايا التمسك بقع الحمض النووي.
