الكتاب أشكر W. الشمس وK. يانسن للمناقشات حاسمة، وتقر الدعم من الميكانيكا الحيوية مختبر النانو في جامعة سنغافورة الوطنية. يعترف NAK الدعم من معهد التمويل الدولي زمالة ماري كوري.

حصاد 1. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول MD-MBA-231 الخلايا من 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. فصل الخلايا من لوحة زراعة الأنسجة باستخدام 0.5٪ التربسين-EDTA الحل. استخدام 1 مل من محلول التربسين-EDTA لخلايا مستنبتة في قارورة T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه في 15 مل أنبوب مخروطي بواسطة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق، ونضح طاف، وخلايا resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كثافة الخلايا، ρ، وذلك باستخدام عدادة الكريات. ملاحظة: لتحضير هلام خلية المصنفة الداخلي، وسوف وقت لاحق أن تضعف تعليق الخلية 10 × للوصول إلى النهائي كثافة البذر الخلية. ولذلك، مطلوب 10 × تعليق خلية مركزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم المتوسطة المطلوبة لتحقيق تركيز × 10 خلية: <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> ملاحظة: النهائية كثافة البذر الخلية، ج نهائي، من حوالي 215؛ 10 6 خلية / مل ويوصى لMD-MBA-231 الخلايا ويستخدم في هذا البروتوكول. ويمكن أيضا كثافة البذر أخرى يتم استكشافها لأنواع الخلايا الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه واحد المزيد من الوقت في 15 مل أنبوب مخروطي بواسطة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق، ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في المبلغ المطلوب (V المتوسطة المحسوبة في الخطوة 1.3) من المصل خالية مستنبت الخلية بدقة للحد من التثاقل الخلية. ملاحظة: الفينول الأحمر هو لصناعة السيارات في الفلورسنت، ويمكن أن تتداخل مع التصوير مضان / الانعكاس. ويمكن اعتبار استخدام الفينول خالية من اللون الأحمر المتوسطة لتحقيق أفضل جودة الصورة. </li></ol> 2. إعداد حلول الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على محلول المخزون الكولاجين، 10 × PBS العازلة، ميلي-Q H 2 O، 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، وعدة أنابيب microcentrifuge. إبقاء كل شيء على الجليد لمنع سابق لأوانه الكولاجين البلمرة، والحفاظ على حالة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن على glass- عقيمةطبق السفلي من قبل الاحترار في C حاضنة 37 درجة. ملاحظة: وقد تم تحسين كافة وحدات التخزين في هذا البروتوكول لطبق من الزجاج السفلي مع 12 ملم جيدا. إذا تم استخدام نوع آخر طبق، وضبط كميات تبعا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم المطلوبة اللازمة لإعداد 50 ميكرولتر من 2.4 ملغ / مل حل الكولاجين لهلام الداخلي (الحل I) على أساس تركيز الأسهم الكولاجين. ملاحظة: يمكن أيضا تركيزات الكولاجين أخرى للهلام الداخلي استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية)، إضافة ببطء 5 ميكرولتر من 10 × PBS عازلة لالمبلغ المطلوب من محلول المخزون الكولاجين (المحسوبة في الخطوة 2.3) مع يحوم طيف. الحرص على تجنب تشكيل فقاعة الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من الخليط إلى 7.4 باستخدام 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم باستخدام معايرة درجة الحموضة متر. كدليل الخام، استخدم حوالي 5 ميكرولتر لجلب وثيقة الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 (قد تختلف كمية اعتمادا على تركيز الأسهم ودرجة الحموضة). ملاحظة: لاحظ أن حجم المشاركة في هذاخطوة صغيرة جدا لاستخدام معيار درجة الحموضة متر. استخدم إحدى الحيل التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الكولاجين لعينات متعددة. ضبط درجة الحموضة بكميات كبيرة باستخدام معيار درجة الحموضة متر وتوزيع حلول الكولاجين عبر العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، وضبط درجة الحموضة من حل الكولاجين في حجم أكبر (ط. ه.، وحدة التخزين التي تسمح باستخدام معيار درجة الحموضة متر). لاحظ مقدار هيدروكسيد الصوديوم اللازمة لتحقيق درجة الحموضة إلى الرقم الهيدروجيني النهائية. تقليص أحجام واستخدام كمية مناسبة من هيدروكسيد الصوديوم للتجربة. تأكيد قيمة الرقم الهيدروجيني باستخدام ورقة عباد الشمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلاف ذلك، واستخدام القطب درجة الحموضة الجزئي لضبط أكثر دقة الرقم الهيدروجيني للكميات الصغيرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حل لحجم 45 ميكرولتر باستخدام H 2 O. تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لمنع سابق لأوانه الكولاجين بلمرة. </li></ol> 3. تشكيل المركزة جل الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ طبق من الزجاج السفلي قبل تحسنت (راجع الخطوة 2.2) من الالبريد الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من تعليق خلية تتركز 10 × (المعد في الخطوة 1.5) إلى حل I. و resuspend بدقة. الحرص على تجنب تشكيل فقاعة الهواء. الخليط لديها الآن حجم 50 ميكرولتر ويحتوي على التركيز النهائي الكولاجين (2.4 ملغ / مل)، وكثافة الخلية (ج النهائي = 2 × 10 6 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من الحل التي تحتوي على خلية I ببطء الى وسط البئر، بحيث تشكل قطرة (الشكل 1A) على شكل قبة. الحرص على تجنب تشكيل فقاعة في هذه الخطوة. إذا كان أشكال فقاعة، بعناية ولكن سرعان ما حاول أي تمزق أو تمتص بها باستخدام طرف ماصة. وضع بلطف الطبق مرة أخرى في حاضنة للسماح للهلام الداخلي تتبلمر لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل O (لالخارجي، لا خلوي جل الكولاجين) حوالي 15 دقيقة قبل نهاية هذه الخطوة الحضانة. ملاحظة: يمكن أن تختلف وحالة هلام الخارجية من حيث تركيز الكولاجين والبلمرة درجة الحموضة لالحصول على شبكات مع المجهرية مختلفة 10. في هذا البروتوكول، والتركيز على 1،5-4،0 ملغ / مل جل الكولاجين بلمرة في الرقم الهيدروجيني من 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنادا إلى تركيز الأسهم الكولاجين، وحساب حجم المطلوبة اللازمة لإعداد 200 ميكرولتر من الكولاجين حل O في التركيز النهائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 10 × PBS عازلة ببطء إلى المبلغ المطلوب من محلول المخزون الكولاجين (المحسوبة في الخطوة 3.4) مع يحوم طيف. ضبط درجة الحموضة من هذا المزيج على درجة الحموضة النهائية باستخدام 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم مع استخدام معايرة درجة الحموضة متر. انظر الملاحظة إلى الخطوة 2.5 بشأن تعديل درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق الحل إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر باستخدام H 2 O. تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لمنع سابق لأوانه الكولاجين بلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ طبق من الحاضنة بعد 45 دقيقة البلمرة من هلام الداخلي (راجع الخطوة 3.3). بلطف إضافة 180 ميكرولتر من حل يا على الجزء العلوي من هلام الداخلي، حتى أن الحل يغطي تماما الداخليةهلام ويملأ البئر (الشكل 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ هذه الخطوة بعناية دون اثارة الحل، والتي يمكن أن تؤدي إلى توجهات الألياف غير موحدة في هلام الخارجي. الحرص على تجنب لمس هلام الداخلي مع طرف ماصة، وتجنب تشكيل فقاعات أو جيوب الهواء. إذا كان أشكال فقاعة، بعناية ولكن سرعان ما حاول أي تمزق أو تمتص بها باستخدام طرف ماصة. وضع بلطف الطبق مرة أخرى في حاضنة للسماح للبلمرة هلام الخارجي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ طبق من الحاضنة بعد 45 دقيقة من البلمرة. يجب بالفعل أن يتعزز هلام إلى حد ما في هذه المرحلة، على الرغم من أنه لا يزال من فصل من السطح السفلي إذا ما تم تناوله تقريبا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب بلطف 2 مل من درجة حرارة متوسطة ثقافة الخلية إلى الطبق (الشكل 1C). تأكد من أن الجل وغمرت تماما في المتوسط. تحديث المتوسطة كل 2 - 3 أيام طوال مدة الثقافة. </li></ol></li></ol> 4. تعيش خلية التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر المقلوب مجهزة قدرة التصوير الخلية الحية على المدى الطويل. يتضمن المدمج في غرفة الحضانة في درجة حرارة (37 درجة مئوية) وCO 2 (5٪) السيطرة. التبديل على المجهر والاحماء المرحلة لا يقل عن 1 ساعة قبل بدء التجربة. ملاحظة: استخدام عدسة الهدف مع مسافة العمل طويلة لتحسين المراقبة وتوطين الخلايا في المواد الهلامية 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجل في المتوسط ​​تحتوي على 5 ميكرولتر من الفلورسنت تعقب خلية الصبغة لمدة 30 دقيقة للسماح للتوطين دقيقة من الخلايا في نظام 3D. وفي وقت لاحق، وإزالة صبغة غير منضم عن طريق الغسيل ثلاث مرات مع 1 × PBS. بعد ذلك، إضافة مستنبت الخلية إلى الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ طبق من الحاضنة ووضعه على المسرح المجهر (الشكل 1D). ملاحظة: التصوير الخلية الحية يمكن أن تبدأ من حيث المبدأ الحق بعد البلمرة من هلام الخارجي. لكن في هذه المرحلة، والخلايا طن جل الداخلية لم ينتشر بعد. لدراسة هجرة الخلايا الأولى التي غزت جل الخارجي، ويمكن تصوير الخلايا الحية تبدأ 24 ساعة (اعتمادا على نوع من الخلايا) بعد الشروع في الثقافة. كدليل الخام، وحوالي 12 - هناك حاجة إلى 14 يوما للثقافة لمعظم الخلايا في هلام الداخلي لدخول هلام الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وحدات التخزين من عرض (في VOV) في مناطق في هلام الخارجي المحيطة هلام الداخلي. بعد 24 ساعة من الحضانة، وانتشرت سكان الخلية، عبر واجهة بين المواد الهلامية الداخلية والخارجية، والتي لغزو هلام الخارجي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي VOV، وتشمل المناطق هلام فورا بجانب واجهة جل والمناطق المتوسطة، والمناطق القريبة من ضواحي من هلام الخارجي 7. استبعاد مناطق أقرب من 50 ميكرون من القاع والجانب السطوح، وكذلك من الجزء العلوي من هلام، لتجنب الآثار حافة الممكنة. كل VOV عادة تدابير 647 × 647 × 100 ميكرون 3 (في العاشر، ذ، ض والاتجاهات، على التوالي)، مع فاصل 5 ميكرومتر في Z -stack. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم اختيار ضمان وسائل التصوير، وقنوات / المرشحات، والتعرض مرات، والقرارات الصورة بشكل صحيح. للتصوير خالية من التسمية من شبكة الكولاجين، واستخدام متحد البؤر الانعكاس المجهري في وقت واحد خلال الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ عينة من الصور، رسم المدرج الاحصائي كثافة، وضبط المكاسب والتعويضات لمراقبة إشارة كافية وتجنب الإشباع عن طريق ضمان أن الرسم البياني يقع بين الصفر وأقصى كثافة. لا تغيير هذه الإعدادات أي أكثر من ذلك طوال مدة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ الوقت الفاصل بين الصور من ال VOV مختارة، مع فاصل زمني، Δ ر، من 10 دقيقة لمدة 8 ساعات (أو أكثر إذا لزم الأمر). </li></ol> 5. تتبع خلية وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ صورة الكمية مرحلة ما بعد المعالجة من الصور -stack ض باستخدام appropria<html> الشركة المصرية للاتصالات ومعالجة الصور البرمجيات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزء من الوقت الفاصل بين الصور لتحديد مواقع خلية 3D في (س، ص، ض، ر) تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل إطار، والتحقق يدويا من دقة الترجمة وإزالة ايجابيات كاذبة بسبب الحطام الخلية ونتوءات الخلوية التي قد تكون مخطئا للخلايا. إزالة الخلايا التكاثري من التحليل والخلايا المتداخلة أو متصلة تقسيم إلى أشياء مختلفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد مسارات خلية الوقت الفاصل 3D من إحداثيات الخلية (س، ص، ض، ر) التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة من خلال ربط موقع كل خلية في التسلسل الزمني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على الضجيج العشوائي والنظام عن طريق إزالة المسارات أقصر من طول عتبة المسار (عادة 20 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح عينة الانجراف من خلال طرح نزوح الصافية الإجمالية من المسارات إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تشريد الخلية،ديزيل / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;العرض =&quot; 80 &quot;/&gt;، والمسافة الهجرة الخلية، <img alt="المعادلة 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> ، من مسارات خلية الملحوظة، حيث هو متجه يمثل الموقع 3D خلية في وقت وهو العدد الإجمالي من النقاط الوقت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب سرعة خلية كما S = د / (ن • Δ ر)، حيث Δ t هو الفاصل الزمني بين الإطارات. حساب الاتجاهية الهجرة الخلية (أو استمرار) باستخدام P = Δd / د. هذا الإجراء البسيط للاستمرار يعني أن لP = 0 تشريد الصافي هو صفر وP = 1 مسار هو خط الاتجاه المستقيم. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

هجرة الخلايا تلعب دورا رئيسيا في مختلف الاستجابات الفسيولوجية مثل التطور الجنيني، تخثر الدم، والاستجابة المناعية وكذلك في العمليات المرضية مثل أمراض الأوعية الدموية، والالتهابات، والسرطان 1. تشريح العوامل الكيميائية الحيوية والفيزياء الحيوية الكامنة وراء الهجرة الخلية لذا فمن المهم أساسي ليس فقط لفهم المبادئ الأساسية للالوظائف الخلوية، ولكن أيضا لتعزيز مختلف التطبيقات الطبية الحيوية، كما هو الحال في هندسة الأنسجة، ومكافحة ورم خبيث وتطوير الأدوية المضادة للالتهابات. منذ المراقبة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا، وقد تركز الكثير من الجهود في المختبر على خلاصة الهجرة الخلية. في أساليب المختبر لدراسة الهجرة الخلية إلى حد كبير تصميم لفحوصات على اثنين من الأبعاد (2D) الأسطح، وأبرزها الصفر أو التئام الجروح فحص 2. هذه المقايسات تقدم الإعداد التجريبية بسيطة وسهلة live-التصوير الخلية، وتوفير معلومات مفيدة في مختلف الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء الهجرة الخلية. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات لا تمثل مصفوفة خارج الخلية (ECM) والهندسة المعمارية وإعادة عرض، والتي هي جوانب هامة في فهم الهجرة في الجسم الحي. في الآونة الأخيرة، فقد كان موضع تقدير متزايد أن نموذج الثقافة 3D، وغالبا في مصفوفات القائم على الكولاجين 3، ويوفر منصة يشبه الوضع على نحو أفضل في الجسم الحي. في الواقع، وخلايا يحمل ديناميات migrational التي تختلف عن تلك التي على الأسطح 2D، خصوصا بسبب أبعاد مختلفة من البيئة 4. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية الحيوية والميكانيكية للمصفوفة تؤثر بحساسية الهجرة الخلية 5، بما في ذلك في سياق غزو الخلايا السرطانية 6. هنا، فإننا نقدم وسيلة لدراسة السلوك 3D الهجرة خلية في ECM مع خصائص الفيزيائية الحيوية التي يمكن أن تكون متنوعة بسهولة مع ظروف التحضير. الخلايا هيالمصنف في &quot;هلام الداخلي&quot; ويسمح للهروب من وغزو في البداية اخلوي &quot;هلام الخارجي&quot;. ويعتمد هذا الأسلوب على قدرة الخلايا على التعرف على وجود، والميل إلى الهجرة إلى أقاليم خالية من الخلايا في هلام الخارجي، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا خلية mechanosensing 7. في هذه الدراسة، ونحن توظيف شبكات الكولاجين باسم موبينيل غزتها خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MD-MBA-231. الخواص الميكانيكية والمجهرية من كل من المواد الهلامية الداخلية والخارجية يمكن ضبطها 8 و 9 تتميز لتحقيق الشروط ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. إعادة الإعمار وتحليل المسارات خلية تسمح الفحص الكمي مفصلا للسلوك الهجرة الزماني المكاني على المستويين السكان ومستوى الخلية الفردية. الأهم من ذلك أن الإعداد للنظام هلام متحدة المركز يحاكي في الجسم الحي طوبولوجيا الأنسجة التي تواجهها الخلايا المهاجرة، وخاصة غزو الخلايا السرطانية، وبالتالي تقديم رؤى مهمة فيإلى الآليات المادية للهجرة الخلايا والانبثاث.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

قدرة الخلايا على الهجرة أمر بالغ الأهمية في مجموعة واسعة من وظائف الخلية في جميع مراحل الحياة من التطور الجنيني والتئام الجروح إلى الورم والانبثاث السرطان. وعلى الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال غير مفهومة مبادئ الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الأساسية للهجرة الخلية بالكامل، وخاصة في ثلاثية الأبعاد (3D) microenvironments ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نحن تصف مقايسة في المختبر يهدف إلى إتاحة الفحص الكمي لل3D السلوكيات الهجرة الخلية. طريقة يستغل القدرة mechanosensing الخلية والميل إلى الهجرة إلى المصفوفة خارج الخلية غير مأهولة سابقا (ECM). نحن نستخدم غزو خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MDA-MB-231، في المواد الهلامية الكولاجين كنظام نموذج. انتشار السكان الخلية وديناميات الهجرة من الخلايا الفردية خلال الأسابيع الثقافة يمكن رصدها باستخدام التصوير الخلية الحية وتحليلها لاستخراج البيانات حل spatiotemporally. علاوة على، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة للمصفوفات خارج الخلية متنوعة، مما يتيح وسيلة بسيطة لكنها قوية للتحقيق في دور العوامل الفيزيائية الحيوية في المكروية على الهجرة الخلية.

تم إجراء فحص هلام متحدة المركز المقدمة هنا باستخدام خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MDA-MB-231، مع 2.4 ملغ / مل الداخلي جل الكولاجين وكثافة البذر خلية = 2 × 10 6 خلية / مل، وكمثال على ذلك. كما هو مبين في الشكل 2، وعادة بعد بضعة أيام من الثقافة، خرقت الخلايا واجهة...

Watch this Scientific Journal Video about Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration at JoVE.com

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

الخواص الميكانيكية والمجهرية من المصفوفة خارج الخلية تؤثر بقوة الهجرة 3D من الخلايا. طريقة في المختبر لدراسة السلوك الزماني المكاني هجرة الخلايا في بيئات متغيرة biophysically، في كل من السكان ومستويات الخلايا الفردية، يوصف.

نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Views.  FOM Institute AMOLF.  الخواص الميكانيكية والمجهرية من المصفوفة خارج الخلية تؤثر بقوة الهجرة 3D من الخلايا. طريقة في المختبر لدراسة السلوك الزماني المكاني هجرة الخلايا في بيئات متغيرة biophysically، في كل من السكان ومستويات الخلايا الفردية، يوصف. 

Video: Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

استخدام مصفوفات ألياف الكربون النانوية لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ بكفاءة إلى النباتات

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

تسليط الضوء على المؤلف: إطلاق العنان لتحويل النبات من خلال الابتكار باستخدام مصفوفات ألياف الكربون النانوية 

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

استخدام صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا على ركائز صلبة أو مرنة لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ إلى النباتات

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...