بالمقارنة مع جزء PSD، يمكن أن يكون من الممكن لتحديد البروتين متشابك تعمل على المشبك غير ناضجة حول الكسر فيلوبوديا الغنية. استخدمنا الخلايا العصبية الحية للحث على تشكيل قبعة البلعوم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن البروتين النشط في التكوين الاصطناعي يمكن تحديدها من الكسر الغني فيلوبوديا التشجر.
للبدء، إعداد 200x فيتامين ميكس عن طريق حل 100 ملغ من فيتامين ب5, 100 ملغ من كلوريد الكولين, 100 ملغ من حمض الفوليك, 180 ملغ من I-إينوزيتول, 100 ملغ من فيتامين B3, 100 ملغ من فيتامين B6 هيدروكلوريد, و 100 ملغ من هيدروكلوريد الثيامين في 500 مل من الماء فائقة الخطورة باستخدام مزر المغناطيسي. خلط بعناية aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في 20 درجة مئوية. لإعداد محلول الريبوفلافين، قم بحل 100 ملغ من الريبوفلافين في 500 ملغ من الماء فائق الخطورة باستخدام مُثير مغناطيسي.
خلط aliquot بعناية في أنابيب 50 مل وتخزينها في 20 درجة مئوية. لتحضير 1 كلور كلوريد الكالسيوم المولر حل 7.35 غراما من تحلل كلوريد الكالسيوم في 50 مل من الماء فائقة الخطورة باستخدام مُثير مغناطيسي. للحد الأدنى من إعداد المتوسطة الأساسية حل 400 ملغ من كلوريد البوتاسيوم 6، 800 ملغ من كلوريد الصوديوم، 2، 200 ملغ من بيكربونات الصوديوم، 158 ملغ من الصوديوم فوسفات أحادية الصوديوم ثنائي هيدرويت، 7، 000 ملغ من د-جلوكوز، و 200 ملغ من كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدات، و 950 مل من الماء فائقة الخطورة، وذلك باستخدام مُثير مغناطيسي.
بعد ذلك، استخدم ماصة 1 مل مع هياج مستمر على مُحرك مغناطيسي لإضافة 1.8 مل من 1 كلوري كلوريد الكالسيوم المولر إلى MEM بطريقة قطرة. ثم يضاف حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة في MEM إلى 7.25 درجة الحموضة. ثم, إضافة 5 مل من 200x مزيج فيتامين و 200 ميكرولترات من محلول الريبوفلافين إلى MEM.
ضبط حجم حجم المحلل إلى 1000 مل مع الماء فائقة الpure. تصفية الحل باستخدام نظام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينه في 4 درجات مئوية. لإعداد 10x DNase-1 حل الأسهم حل 100 ملغ من Dnase-1 في 12.5 مل من HBSS.
تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون، aliquot في أنابيب 1.5 مل، وتخزين الأنابيب في 20 درجة مئوية. ل Ara-C إعداد الأسهم حل 25 ملغ من آرا-C في 8.93 مل من الماء فائقة الpure. تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون، aliquot في أنابيب 1.5ml، وتخزينها في 20 درجة مئوية.
لإعداد وسط الطلاء، مزيج 1 مل من محلول MEM Amino Acid، 750 ميكرولترات من 1 مولر HEPES، 1 مل من B27، 125 ميكرولترات من 200 ملليمولار الجلوتامين، 250 ميكرولترات من البنسلين-ستربتوميسين، 2.5 مل من مصل البقر الجنيني، و 44.375 مل من MEM في أنبوب 50 مل. لإعداد وسيلة التوقف، مزيج 1 مل من محلول الأحماض الأمينية MEM، 750 ميكرولتر من 1 هبس مول، 5 مل من FBS، و 43.25 مل من MEM في أنبوب 50 مل. لإعداد HBSS، تستكمل مع HEPES 15 ملليمتر، مزيج 49.25 مل من HBSS، و 750 ميكرولترات من 1 مولر HEPES.
لتحضير الأطباق المغلفة بولي-ل-ليسين، معطف 35 مم أطباق ثقافة الخلايا البلاستيكية مع 0.2 ملغ لكل مل من بولي-ل-ليسين هيدروبروميد ليوم واحد في 25 درجة مئوية. بعد ذلك، اغسل الأطباق بـ 2 مل من الماء فائق الخطورة ثلاث مرات وحضنها بـ 1.5 مل من Stop Medium عند 25 درجة مئوية حتى الاستخدام. احتضان فرس النهر تشريح في خليط يحتوي على 500 ميكرولترات كل من 2.5٪ التربسين و 10X Dnase-1 في HBSS تكملها 15 ملليمتر HEPES، درجة ح H 7.2، في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات كل 3 دقائق.
ثم، نقل قرن آمون إلى 10 مل من وقف المتوسطة واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لactivate التربسين. المقبل، احتضان فرس النهر تشريح في 10 مل من محطة جديدة متوسطة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نقل فرس النهر إلى 10 مل من وقفة جديدة متوسطة واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق أخرى.
ثم، نقل قرن آمون في 900 ميكرولتررس من توقف المتوسطة و 100 ميكرولترات من 10X Dnase-1 في أنبوب 15 مل. استخدام ماصة 1 مل لتفكك قرن آمون في الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الأنابيب 20 مرة. إضافة 9 مل من المتوسطة الطلاء، وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون، في أنبوب 50 مل.
عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتات وضبط إلى 3.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر في وسط الطلاء. المقبل، التعرق وسيلة التوقف من الأطباق المغلفة بولي ل-lisine. لوحة 2 مل لكل طبق من الخلايا على الأطباق المغلفة واحتضان تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة 60-64 ساعة.
بعد الحضانة، إضافة 2 ميكرولتررس من Ara-C حل الأسهم إلى الخلايا العصبية ويهز الطبق ببطء. الحفاظ على أطباق الثقافة في مربع مرطب دون تغيير متوسط الثقافة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية. تنقية الزجر فيلوبوديا الغنية بعد 13 يوما في المختبر عن طريق أول إضافة ثلاثة ملايين ميكروبات البوليسترين المغناطيسي في الطبق الواحد إلى 20 أطباق تحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة.
بعد يوم واحد، وغسل الخلايا العصبية في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع ازاحة ثلاث مرات لإزالة الميكروبات المتوسطة وغير المنضمة. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، lyse الخلايا العصبية مع 500 ميكرولتر في طبق من العازلة تحلل. المقبل، وجمع lysate مع مكشطة الخلية ونقل lysate في 10 منخفضة البروتين ربط الأنابيب الدقيقة.
تعيين أنابيب على فصل المغناطيس والانتظار لمدة دقيقة واحدة. جمع نابيرانت واستخدامه كسر غير منضم للفضة تلطيخ وتحليل البقعة الغربية. بعد ذلك، نقل الخرز إلى ميكروتيتوب جديد منخفض البروتين ملزم وتعيين على فصل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.
إزالة تماما من supernatant، وإضافة 500 ميكرولترات من العازلة تحلل. غسل الخرز باستخدام خلاط دوامة لمدة 15 ثانية. كرر غسل الخرز 10 مرات وإزالة افرنح.
بروتينات elute وصولا الى الخرز عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من 1X SDS عينة العازلة ويغلي الأنبوب في 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 860xG 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان وتعيين أنبوب على منفصلة المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. جمع المابير واستخدامها كسر منضم.
قياس تركيزات من غير منضمة ومقيدة البروتين الكسور من قبل BCA المقايسة البروتين. تصور حلول protien مع الأزرق البروموفينيل وضبط التركيز على 5 نانوغرام لكل ميكرولتر لصفحة SDS. فصل الكسور المنضمة وغير المنضمة بواسطة صفحة SDS باستخدام هلام متدرج بنسبة 5-20٪.
الفضة تلطخ الجل. وأخيراً، لطخة غربية باستخدام أجسام مضادة أولية وثانوية مناسبة وفقاً للمخطوطة. في الخلايا العصبية فرس النهر مثقف, وكان موضعية بغزارة TLCN إلى فيلوبوديا التشعب, رمح, و سوما وشارك في ترجمة مع F-actin.
كانت الخرز المشفرة مرتبطة بشكل رئيسي بالدنخ والحث على تكوين أكواب بتحريف من خلال تراكم TLCN و F-actin على dendrites العصبية. أظهرت صور Thorecense أن تشكيل كأس البلعومات كان يعتمد بشكل حاسم على وجود TLCN في dendrites. تم تشكيل الكؤوس البلعوية فقط على الخلايا العصبية فرس النهر من النوع البرية، ولكن ليس على TLCN defficient فرس النهر الخلايا العصبية.
وأظهرت نتائج صفحة SDS أن أنماط نطاق البروتين كانت تقريبا هي نفسها بالنسبة للكسور غير المنضمة والمقيدة ولكن الكثافة في 50 و 70 كيلودالون، في الكسر المقيد كانت أقل من تلك الموجودة في الكسر غير المنضم. ومع ذلك ، فإن كثافة الفرقة لم تكن مختلفة بوضوح بين الكسور غير المقيدة والمضمونة المعدة من TLCN defficient الثقافة فرس النهر الخلايا العصبية. وأظهر تحليل البقعة الغربية للكسور غير المنضمة والمقيدة أن TLCN و VN تم اكتشافهما بشكل رئيسي في الكسر المقيد.
اكتين، عزرين، G ألفا س، المجلس التشريعي الفلسطيني بيتا 1، MAP-2، وسبيكترين، تم الكشف عنها في كل من الكسور المنضمة وغير المنضمة. تم الكشف عن Moesin، PSD-95، ألفا-أكتينين، وألفا توبولين في الكسر غير المنضم. إذا تغير بروتين الطلاء من الميكروبات ، يمكن تطبيق هذا الإجراء لتحديد التفاعل الفحص.
هذه التقنية يمكن أن تحدد البروتين العامل على المواد الاصطناعية. لذلك نعتقد أن الآلية التكوين الاصطناعي يمكن قياسها كميا. ونحن نعتقد أن البروتين الجديد المرتبطة بالاضطراب العقلي يمكن تحديدها من الكسر الكارني فيلوبوديا الغنية.
ويمكن أن تمتد إلى العلاج.
