Comparé à la fraction de PSD, il peut être possible d’identifier la protéine synaptique agissant sur la synapse immature autour de la fraction filopodia-riche dendritique. Nous avons utilisé le neurone vivant pour induire la formation phagocytique de chapeau. Le principal avantage de cette technique est que la protéine active dans la genèse artificielle pourrait être identifiée à partir de la fraction riche en filopodes dendritiques.
Pour commencer, préparer 200x Vitamin Mix en dissolvant 100 mg de vitamine B5, 100 mg de chlorure de choline, 100 mg d’acide folique, 180 mg d’i-inositol, 100 mg de vitamine B3, 100 mg d’hydrochlorure de vitamine B6 et 100 mg d’hydrochlorure de thiamine dans 500 ml d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique. Mélanger délicatement l’aliquot dans des tubes de 50 ml et le conserver à 20 degrés Celsius. Pour préparer la solution riboflavine, dissoudre 100 mg de riboflavine dans 500 mg d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique.
Mélanger délicatement l’aliquot dans des tubes de 50 ml et les conserver à 20 degrés Celsius. Pour préparer un dichloride de calcium molaire dissoudre 7,35 grammes de chlorure de calcium dihydrate dans 50 ml d’eau ultrapure à l’aide d’un agitateur magnétique. Pour la préparation moyenne essentielle minimale dissoudre 400 mg de chlorure de potassium 6, 800 mg de chlorure de sodum, 2 200 mg de bicarbonate de sodium, 158 mg de dihydrate monobasique de phosphate de sodium, 7 000 mg de D-glucose et 200 mg d’héptahydrate de sulfate de magnésium, et 950 ml d’eau ultrapure, à l’aide d’un agitateur magnétique.
Ensuite, utilisez une pipette de 1 ml avec une agitation constante sur un agitateur magnétique pour ajouter 1,8 ml de 1 dichloride de calcium molaire au MEM d’une manière goutte par goutte. Ajouter ensuite l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH du MEM au pH 7,25. Ensuite, ajoutez 5 ml de mélange vitaminique 200x et 200 microlitres de solution riboflavine au MEM.
Ajuster le volume du volume de la solution à 1000 ml avec de l’eau ultrapure. Filtrez la solution à l’aide d’un système de filtre de 0,22 micron et stockez-la à 4 degrés Celsius. Pour préparer 10x DNase-1 solution stock dissoudre 100 mg de Dnase-1 dans 12,5 ml de HBSS.
Filtrer à travers un filtre de 0,22 micron, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker les tubes à 20 degrés Celsius. Pour la préparation de solution de stock Ara-C dissoudre 25 mg d’Ara-C dans 8,93 ml d’eau ultrapure. Filtrer à travers un filtre de 0,22 micron, aliquot dans des tubes de 1,5 ml, et stocker à 20 degrés Celsius.
Pour préparer le support de placage, mélanger 1 ml de solution d’acides aminés MEM, 750 microlitres de 1 molaire HEPES, 1 ml de B27, 125 microlitres de glutamine de 200 millimolaires, 250 microlitres de pénicilline-streptomycine, 2,5 ml de sérum bovin fœtal et 44,375 ml de MEM dans un tube de 50 ml. Pour préparer l’arrêt moyen, mélanger 1 ml de solution d’acides aminés MEM, 750 microlitres de 1 molaire HEPES, 5 ml de FBS et 43,25 ml de MEM dans un tube de 50 ml. Pour préparer le HBSS, complété par 15 millimolar HEPES, mélanger 49,25 ml de HBSS, et 750 microlitres de 1 molaire HEPES.
Pour la préparation des plats enrobés de poly-l-lysine, enrober les plats de culture cellulaire en plastique de 35 mm de 0,2 mg par ml d’hydrobromide poly-l-lysine pendant une journée à 25 degrés Celsius. Ensuite, lavez la vaisselle avec 2 ml d’eau ultrapure trois fois et incubez-les avec 1,5 ml d’arrêt moyen à 25 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Incuber l’hippocampe disséqué dans un mélange contenant 500 microlitres chacun de 2,5% trypsine et 10X Dnase-1 en HBSS complété par 15 millimolar HEPES, pH 7,2, à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec agitation toutes les 3 minutes.
Ensuite, transférez l’hippocampe à 10 ml du Stop Medium et incubez à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour inactiver la trypsine. Ensuite, incuber l’hippocampe disséqué dans 10 ml d’arrêt frais moyen à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Déplacez l’hippocampe dans 10 ml de milieu d’arrêt frais et incubez à 4 degrés Celsius pendant encore 5 minutes.
Ensuite, déplacez l’hippocampe en 900 microlitres du milieu d’arrêt et 100 microlitres de 10X Dnase-1 dans un tube de 15 ml. Utilisez une pipette de 1 ml pour dissocier l’hippocampe en neurones isolés en pipetting 20 fois. Ajouter 9 ml de platage moyen et filtrer à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 ml.
Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un ajustement à 3,5 fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans le milieu de placage. Ensuite, aspirez le milieu d’arrêt des plats enrobés de poly-l-lisine. Assiette 2 ml par plat des cellules sur les plats enduits et incuber sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 60-64 heures.
Après l’incubation, ajouter 2 microlitres de solution de stock Ara-C aux neurones et secouer le plat lentement. Gardez les plats de culture dans une boîte humidifiée sans changer le milieu de culture sous 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Purifier la fraction riche en filopodes dendritiques après 13 jours in vitro en ajoutant d’abord trois millions de microbilles magnétiques de polystyrène par plat à 20 plats contenant les neurones cultivés.
Après une journée, laver les neurones dans 1 ml de PBS avec agiation trois fois pour enlever les microbilles moyennes et non liées. Après avoir enlevé PBS, lyse les neurones avec 500 microlitres par plat du tampon de lyse. Ensuite, recueillir le lysate à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer le lysate en 10 microtubes liant les protéines faibles.
Placez les tubes sur un séparateur d’aimant et attendez une minute. Recueillir le supernatant et l’utiliser comme la fraction non lié pour la coloration d’argent et l’analyse des taches occidentales. Ensuite, transférez les perles sur un nouveau microtube liant à faible teneur en protéines et placez-les sur un séparateur magnétique pendant une minute.
Retirez complètement le supernatant et ajoutez 500 microlitres du tampon de lyse. Laver les perles à l’aide d’un mélangeur Vortex pendant 15 secondes. Répétez le lavage des perles 10 fois et retirez le surnatant.
Protéines elute jusqu’aux perles par l’ajout de 50 microlitres de tampon échantillon 1X SDS et faire bouillir le tube à 98 degrés Celsius pendant 5 minutes. Centrifugez le tube à 860xG 3000 RPM pendant 10 secondes et réglez le tube sur un séparateur magnétique pendant une minute. Recueillir le supernatant et l’utiliser comme la fraction liée.
Mesurer les concentrations des fractions de protéines non liées et liées par l’analyse des protéines BCA. Visualisez les solutions protien avec du bleu bromophényl et ajustez la concentration à 5 nanogrammes par microlitre pour la page SDS. Séparez les fractions liées et non liées par page SDS à l’aide d’un gel de gradient de 5 à 20 %.
L’argent tache le gel. Enfin, tache occidentale utilisant des anticorps primaires et secondaires appropriés selon le manuscrit. Dans les neurones hippocampaux cultivés, TLCN a été abondamment localisé à la filopodia dendritique, arbre, et soma et co-localisé avec F-actin.
Les perles codées étaient principalement liées aux dendrites et induisent la formation de tasses phagocytiques par accumulation de TLCN et de F-actin sur les dendrites neuronaux. Les images de Thorecense ont montré que la formation phagocytique de tasse était crucialement dépendante de la présence de TLCN dans les dendrites. Les tasses phagocytiques ont été formées seulement sur les neurones hippocampal sauvages de type, mais pas sur les neurones hippocampal déficients de TLCN.
Les résultats de la page SDS ont montré que les modèles de bande protéique étaient presque les mêmes pour les fractions non liées et liées, mais les intensités à 50 et 70 kilodalton, dans la fraction liée étaient inférieures à celles de la fraction non liée. Cependant, l’intensité de la bande n’était évidemment pas différente entre les fractions non liées et liées préparées à partir de neurones hippocampaux de culture déficients TLCN. L’analyse occidentale de tache des fractions non liées et liées a prouvé que TLCN et VN ont été principalement détectés dans la fraction liée.
Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 et Spectrin ont été détectés dans les fractions liées et non liées. Moesin, PSD-95, alpha-Actinin, et alpha-Tubulin ont été détectés dans la fraction non consolidée. Si la protéine de revêtement des microbilles change, cette procédure peut être appliquée pour identifier l’interaction d’essai.
Cette technique pourrait identifier la protéine travaillant sur des substances artificielles. Nous croyons donc que la genèse artificielle du mécanisme peut être quantifiée. Nous croyons que la nouvelle protéine liée au désordre mental peut être identifiée de la fraction filopodia-riche dendritique.
Et peut être étendu à la thérapie.
