PSD fraksiyonu ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia açısından zengin fraksiyonu etrafında olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket eden sinaptik proteini tanımlamak mümkün olabilir. Fagositik kapak oluşumunu tetiklemek için canlı nöron kullandık. Bu tekniğin en büyük avantajı, yapay yaratılıştaki aktif proteinin dendritik filopodia zengin fraksiyonundan saptanabildiğidir.
Başlamak için, B5 vitamini 100 mg eriterek 200x Vitamin Mix hazırlamak, Kolin Klorür 100 mg, Folik Asit 100 mg, I-inositol 180 mg, B3 vitamini 100 mg, B6 vitamini hidroklorür 100 mg, ve 100 ultrasaf su 500 ml ultrasaf su 500 ml ultrasaf su kullanarak. Aliquot'u 50 ml'lik tüplerde dikkatlice karıştırın ve 20 santigrat derecede saklayın. Riboflavin çözeltisi hazırlamak için, manyetik bir karıştırıcı kullanarak ultrasaf su 500 mg riboflavin 100 mg çözünür.
Aliquot'u 50 ml'lik tüplerde dikkatlice karıştırın ve 20 santigrat derecede saklayın. Bir azı kalsiyum diklorür hazırlamak için manyetik bir karıştırıcı kullanarak ultrasaf su 50 ml kalsiyum klorür dihidrat 7,35 gram çözünür. Minimum Esansiyel Orta hazırlık için 400 potasyum klorür mg 6, sodum klorür 800 mg, sodyum bikarbonat 200 mg, sodyum fosfat monobasic dihidrat 158 mg, 7, 000 D-glikoz mg, ve magnezyum sülfat heptahidrat 200 mg, ve ultrasaf su 950 ml, manyetik bir karıştırıcı kullanarak.
Daha sonra, bir damla şekilde MEM için 1 molar kalsiyum diklorür 1.8 ml eklemek için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sürekli ajitasyon ile 1 ml pipet kullanın. Daha sonra MEM'in pH'ını pH 7.25'e ayarlamak için hidroklorik asit ekleyin. Daha sonra MEM'e 5 ml 200x vitamin karışımı ve 200 mikrolitre riboflavin çözeltisi ekleyin.
Çözeltinin hacmini ultra saf su ile 1000 ml'ye ayarlayın. Çözeltiyi 0,22 mikron filtre sistemi kullanarak filtreleyin ve 4 santigrat derecede saklayın. 10x DNase-1 stok çözeltisi hazırlamak için 100 mg Dnase-1'i 12,5 ml HBSS'de çözünür.
Filtre 0.22 mikron filtre, 1.5 ml tüpler içinde aliquot, ve 20 santigrat derece tüpleri saklayın. Ara-C stok çözeltisi hazırlama için 25 mg Ara-C 8.93 ml ultrasaf suda çözünür. Filtre 0.22 mikron filtre, 1.5ml tüpler içinde aliquot ve 20 derece santigrat de saklayın.
Kaplama Ortamını hazırlamak için 1 ml MEM Amino Asit Solüsyonu, 750 mikrolitre 1 molar HEPES, 1 ml B27, 125 mikrolitre 200 milimolar glutamin, 250 mikrolitre penisilin-streptomisin, 2,5 ml Fetal Sığır Serumu ve 50 ml'lik mem 44.375 ml'yi karıştırın. Durdurma ortamını hazırlamak için 1 ml MEM amino asit çözeltisi, 750 mikrolitre 1 molar HEPES, 5 ml FBS ve 50 ml'lik bir tüpte 43,25 ml MEM'i karıştırın. 15 milimolar HEPES ile desteklenen HBSS hazırlamak için 49.25 ml HBSS ve 750 mikrolitre 1 molar HEPES karıştırın.
Poli-l-lizin kaplamalı yemekler in hazırlanması için, 25 santigrat derecede bir gün boyunca ml başına 0,2 mg poli-l-lizin hidrobromür ile 35 mm plastik hücre kültürü yemekleri kat. Daha sonra, bulaşıkları 2 ml ultrasaf su ile üç kez yıkayın ve kullanıma kadar 25 santigrat derecede 1,5 ml Stop Medium ile kuluçkaya yatırın. 15 milimolar HEPES, pH 7,2, 37 derece santigrat ile desteklenen HBSS 500 mikrolitre her biri 2.5% tripsin ve 10X Dnase-1 içeren bir karışım içinde diseksiyon hipokampi kuluçka 3 dakikada bir ajitasyon ile 15 dakika.
Daha sonra hipokampi Stop Medium'un 10 ml'sine aktarın ve tripsinin inaktive etmek için 4 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 5 dakika boyunca 4 derece santigrat taze stop orta 10 ml diseksiyon hipokampi kuluçka. Hippocampi'yi 10 ml taze stop ortasına taşıyın ve 4 santigrat derecede 5 dakika daha kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, 15 ml tüp içinde durdurmak orta 900 mikrolitre ve 10X Dnase-1 100 mikrolitre içine hipokampi taşıyın. 20 kez pipetleme tarafından izole nöronlar içine hipokampi ayrıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Kaplama orta 9 ml ekleyin ve bir filtre 70 mikron hücreli süzgeç ile, bir 50 ml tüp içine.
Hemositometre kullanan hücre sayısını ve kaplama ortamındaki mililitre başına 4 hücreye 3,5 kez 10'a ayarlayın. Daha sonra, poli-l-lisine kaplı yemeklerden stop orta aspire. Tabak 2 ml kaplamalı yemekler üzerinde hücrelerin çanak başına ve 60-64 saat boyunca 37 santigrat derece% 5 karbondioksit altında kuluçka.
Kuluçkadan sonra, nöronlara 2 mikrolitre Ara-C stok çözeltisi ekleyin ve yemeği yavaşça sallayın. Kültür yemeklerini 37 santigrat derecede %5 karbondioksit altında kültür ortamını değiştirmeden nemlendirilmiş bir kutuda saklayın. İlk kültürlü nöronlar içeren 20 yemekler için çanak başına üç milyon manyetik polistiren mikroboncuklar ekleyerek 13 gün in vitro sonra dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırın.
Bir gün sonra, orta ve bağlı olmayan mikroboncuklar kaldırmak için agiation üç kez PBS 1 ml nöronlar yıkayın. PBS çıkardıktan sonra, lysis tampon çanak başına 500 mikrolitre ile nöronları lyse. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı ile lysate toplamak ve 10 düşük protein bağlayıcı mikrotüpler içine lysate aktarın.
Bir mıknatıs ayırıcı tüpler ilerler ve bir dakika bekleyin. Supernatant toplamak ve gümüş boyama ve Batı leke analizi için sınırsız fraksiyonu olarak kullanabilirsiniz. Daha sonra, boncukları yeni bir düşük protein bağlayıcı mikrotüp e aktarın ve bir dakika lığına manyetik bir ayırıcıya ayarlayın.
Tamamen supernatant çıkarın ve lysis tampon 500 mikrolitre ekleyin. 15 saniye boyunca bir Vortex karıştırıcı kullanarak boncukyı yıkayın. Boncukların yıkanması 10 kez tekrarlayın ve supernatant çıkarın.
1X SDS örnek tampon 50 mikrolitre ilave edilerek boncuklar aşağı elute proteinlerve 5 dakika boyunca 98 santigrat derece tüp kaynatın. Tüpü 860xG 3000 RPM'de 10 saniye santrifüj edin ve tüpü bir dakika lığına manyetik ayırıcıya ayarlayın. Supernatant toplamak ve bağlı kesir olarak kullanabilirsiniz.
Bağlı olmayan ve bağlı protein fraksiyonlarının konsantrasyonlarını BCA protein tadına göre ölçün. Protien çözeltilerini bromofenil mavisi ile görselleştirin ve SDS sayfası için konsantrasyonu mikrolitre başına 5 nanograma ayarlayın. %5-20 degrade jel kullanarak Bağlı ve bağlanmamış kesirleri SDS sayfası ile ayırın.
Jelgümüş lekesi. Son olarak, batı el yazmasına göre uygun birincil ve ikincil antikorlar kullanarak leke. Kültürlü hipokampal nöronlarda, TLCN bol dendritik filopodia, şaft ve soma lokalize edildi ve F-aktin ile birlikte lokalize.
Kodlanmış boncuklar esas olarak dendritlere bağlıydı ve nöronal dendritler üzerinde TLCN ve F-aktin birikimi ile fagositik kapların oluşumunu neden. Thorecense görüntüleri fagositik fincan oluşumu nun çok önemli ölçüde dendritlerde TLCN varlığına bağlı olduğunu göstermiştir. Fagositik bardaklar sadece yabani tip hipokampal nöronlarda oluşmuştur, ancak TLCN defficient hipokampal nöronlarda oluşmaz.
SDS sayfa sonuçları protein bant desenleri neredeyse bağlı ve bağlı fraksiyonları için aynı olduğunu gösterdi ama yoğunlukları 50 ve 70 kilodalton, bağlı fraksiyonu bu bağlı olmayan fraksiyonu daha düşüktü. Ancak, bant yoğunluğu açıkça TLCN defficient kültür hipokampal nöronlar hazırlanan bağlanmamış ve bağlı fraksiyonları arasında farklı değildi. Bağlanmamış ve bağlı kesirlerin Batı leke analizi TLCN ve VN'nin esas olarak bağlı kesirde tespit edildiğini gösterdi.
Actin, Ezrin, G alfa q, PLC beta 1, MAP-2 ve Spectrin, bağlı ve bağlı olmayan fraksiyonlarda saptanır. Belirsiz fraksiyonda Moesin, PSD-95, alfa-Aktinin ve alfa-Tubulin saptadı. Mikroboncukların kaplama proteini değişirse, bu işlem, hakem etkileşimini tanımlamak için uygulanabilir.
Bu teknik yapay maddeler üzerinde çalışan proteini tanımlayabilir. Bu yüzden yapay yaratılış mekanizmasının ölçülebileceğine inanıyoruz. Biz ruhsal bozukluk ile ilişkili yeni protein dendritik filopodia açısından zengin fraksiyonu tespit edilebilir inanıyoruz.
Ve terapiye kadar uzatılabilir.
