هذا البروتوكول مهم ، لأنه يوفر طريقة لفصل أربع حجرات خلوية عن بعضها البعض ، السيتوبلازم ، النواة ، الميتوكوندريا ، والغشاء. ليس ذلك فحسب ، بل إنه إجراء قابل للتطوير والتكرار وله نتائج موثوقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي فصل أربع حجرات خلوية مع الحد الأدنى من استخدام المنظفات ، مما يسمح بإجراء تجزئة أكثر قابلية للتكرار وموثوقية.
لعزل البروتين الخلوي ، تنمو خلايا U937 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى إجمالي نهائي من ستة في 10 إلى الخلايا الثامنة. قم بالطرد المركزي للثقافة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في درجة حرارة الغرفة PBS إلى تركيز نهائي من أربعة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر ، مع سحب بلطف لتفتيت الكتل. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للتحلل البارد بالجليد A بتركيز نهائي من اثنين في 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.
أضف 7.5 ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب مخروطي على الجليد لاستخراج البروتين النووي في نهاية المطاف ، وقم بتكوير الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في مخزن العزل السيتوبلازمي بتركيز نهائي قدره اثنان × 10 إلى الخلية السابعة لكل ملليلتر ، مع سحب بلطف لتفتيت الكتل ، قبل احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع دوران الطرف على النهاية. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف.
جهاز طرد مركزي للطافي لترسيب الحطام الخلوي. بعد الطرد المركزي ، انقل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وكرر تسلسل الطرد المركزي حتى لا يمكن ملاحظة أي حبيبة. عندما تكون العينة خالية من الحطام، قم بتخزين المادة الطافية المحتوية على الكسر الخلوي لمدة تصل إلى شهر واحد عند أربع درجات مئوية.
ثم أعد تعليق حبيبات الخلية المخزنة في محلول التحلل A إلى تركيز نهائي من أربعة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. لتجانس الخلايا ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية وتخلص من المادة الطافية لإزالة الديجيتونين الزائد والملوثات الانقباضي. أعد تعليق الحبيبات في مخزن تجانس الخلايا الباردة الجليدية بتركيز نهائي من أربعة × 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر لحضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد.
في هذه الأثناء ، بالنسبة للتحلل الميكانيكي القائم على الخرز ، أضف 30 جراما من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ المغسولة مسبقا مقاس 3.2 ملم إلى 15 ملليلترا من محلول التحلل B في أنبوب ملتف سعة 50 ملليلتر على الثلج ليبرد. في نهاية الحضانة ، استبدل المخزن المؤقت في الأنبوب المغطى بتعليق خلوي وامزج الخلايا لمدة خمس دقائق بسرعة ثمانية. بعد التحلل ، انقل التجانس إلى أنبوب نظيف.
جهاز طرد مركزي للتجانس ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لإزالة أي حطام متبقي من العينة ، قم بجهاز الطرد المركزي للتجانس ثلاث مرات كما هو موضح ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد بعد كل طرد مركزي. بعد الطرد المركزي الأخير ، لعزل جزء الميتوكوندريا الخام ، انقل الطافي إلى أنبوب جديد للطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وضع الحبيبات المحتوية على جزء الميتوكوندريا الخام على الجليد. لعزل جزء الغشاء ، قم بجهاز طرد مركزي للطافي الذي تم جمعه ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، ضع الحبيبات المحتوية على جزء الغشاء الخام على الجليد. لتنقية تدرج كثافة isopycnic ، أعد تعليق كريات جزء الميتوكوندريا والغشاء الخام في 200 ميكرولتر من محلول التحلل B ، و 1.8 ملليلتر من اليوديكسانول.
لإنشاء تدرج يوديكسانول متقطع لكل عينة ، أولا ، أضف ملليلترا واحدا من 15٪ يوديكسانول إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق رفيع الجدران مفتوح من الأعلى سعة ثمانية ملليلتر لكل عينة. بعد ذلك ، قم بالتتابع على أساس ملليلتر واحد من 20٪ يوديكسانول ، ملليلتر واحد من 25٪ يوديكسانول ، ملليلتر واحد من 30٪ يوديكسانول ، ومليلتر واحد من 35٪ يوديكسانول تحت طبقة 15٪ يوديكسانول في كل أنبوب. أضف ملليلتر من معلق حبيبات الميتوكوندريا الخام تحت الطبقة السفلية من تدرج واحد ، واثنين ملليلتر من معلق الحبيبات الغشائي الخام أسفل الطبقة السفلية من التدرج الثاني.
ضع بعناية ملليلتر واحد من 10٪ يوديكسانول على الجزء العلوي من كل تدرج وقم بموازنة الأنابيب في حدود 10 ميكروغرام من بعضها البعض عن طريق إضافة 10٪ يوديكسانول حسب الضرورة قبل تنقية أجزاء الميتوكوندريا والأغشية عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. في نهاية الفصل ، استخدم إبرة لثقب جانب الأنابيب رقيقة الجدران لجمع الأشرطة المرئية من كل عينة. لعزل البروتين النووي ، قم بالطرد المركزي لحصة 7.5 ملليلتر من الخلايا المعلقة في محلول التحلل A ، وأعد تعليق الحبيبات في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإذابة الخلايا الباردة الجليدية مع السحب والدوامة.
احتضان التعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة لتعطيل أغشية البلازما والعضيات ، مع حماية البروتينات النووية. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق سحب 800 ميكرولتر من محلول التحلل النووي البارد برفق مع وحدة واحدة لكل ميكرولتر من البنزوناز. احتضان الخليط على دوار من طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية لتعطيل الغشاء النووي.
بعد 30 دقيقة ، صوتنة الخليط ثلاث مرات لمدة خمس ثوان بقوة 20٪ مع توقف لمدة خمس ثوان بين النبضات لقص الأحماض النووية. بعد الصوتنة الأخيرة ، قم بالطرد المركزي للتجانس وجمع المادة الطافية كجزء نووي دون إزعاج الحبيبات. تظهر اللطخة الغربية لكل من الكسور بعد تنقية تدرج الكثافة توطين جزء الميتوكوندريا إلى طبقات 25 و 30٪ من اليوديكسانول ، وتوطين جزء الغشاء إلى طبقات اليوديكسانول 10 و 15٪.
يؤكد تحليل الدم الغربي أيضا أن كل عينة معزولة نقية وخالية من التلوث بالبروتينات من أجزاء أخرى من الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تحليل قياس الكثافة لشدة النطاق لكل عينة قابلية التكرار والأهمية الإحصائية للبيانات. يمكن أن يؤدي التنفيذ غير السليم للتجزئة إلى انتقال تلوث المكونات الخلوية.
يمكن أن يكون التركيز العالي من Histone H3 في الجزء الخلوي ، على سبيل المثال ، بسبب التوضيح غير الصحيح للجزء الخلوي. يمكن أن يؤدي الفشل أثناء تنقية كثافة isopycnic إلى تلوث جزء الغشاء. قد يكون من المفيد إجراء فحص كمي للبروتين قبل تحليل الدم الغربي للتأكد من أن الكسور تحتوي بالفعل على بروتين للسماح بتحميل الجل بناء على كمية البروتين ، وللتأكد من أن الإجراء قد تم تنفيذه بشكل صحيح.
من الأهمية بمكان ألا يحتوي الجزء السيتوبلازمي على حبيبات. يمكن إجراء البقع الغربية ، أو ELISAs باتباع هذا الإجراء للسماح لك بتحليل الموقع تحت الخلوي للبروتينات المختلفة في ظل ظروف معينة. سمحت لنا هذه التقنية بتحليل الاتجار بعوامل موت الخلايا المختلفة في ظل ظروف ارتفاع السكر في الدم.
وهكذا ، بالنسبة لنا ، ساعد هذا في إلقاء الضوء على آلية التحول ارتفاع السكر في الدم من موت الخلايا المبرمج إلى نخر.
