سيتم إثبات إجراءات اختبار السمية من قبل الدكتور أشوك أباتوار، وهو باحث أول من مختبري. ويحدد بروتوكولنا الآثار غير المستهدفة ويكشف عن الآثار السامة الدقيقة للمواد الكيميائية في المرحلة المبكرة من الاكتشاف التي قد تفوت في زراعة الخلايا أو نماذج حيوانية أخرى. المزايا الرئيسية لتقنيتنا هي: أنها سريعة وفعالة، وتتطلب كمية صغيرة جدا من المواد الكيميائية، والمرافق الأساسية في المختبر.
سوف فحص السمية تساعدنا في تحديد تركيز لدراسة كفاءتها ضد البكتيريا التي تسبب السل ولمزيد من الحساب قبل الفحص. وتستخدم هذه الطريقة رؤى في الآثار غير المستهدفة للمواد الكيميائية، وبالتالي يمكن استخدام هذه الطريقة في أي مجال من مجالات البحث حيث تكون سمية المادة الكيميائية ذات أهمية رئيسية. هذه الطريقة بسيطة جدا ويمكن أن يقوم بها أي شخص دون خبرة سابقة.
يجب على الأفراد الذين ليس لديهم خبرة خطة التجربة بعناية واستخدام مركب واحد فقط. توفر هذه الطريقة تأثيرات سامة للمواد الكيميائية في شكل تغيرات في الشكل الظاهري في الأجنة الحمار الوحشي النامية وبالتالي سلامة المركبات التي تم اختبارها. للبدء، ضع 2-5 حمار وحشي ذكر بالغ وثلاثة إلى خمسة حمار وحشي أنثى بالغة في خزانات التزاوج بين عشية وضحاها.
في الصباح، بدوره على ضوء كما هو مستحث تربية من قبل دورة الضوء التلقائي الظلام واللاحقة. لتجنب التعامل مع الإجهاد للحيوانات، والسماح للحيوانات للراحة لمدة أسبوعين قبل استخدام نفس الأفراد للتكاثر. في اليوم التالي قبل الظهر، جمع الأجنة باستخدام مصفاة شبكة غرامة، ونقلها إلى طبق بتري تحتوي على متوسط الجنين E3.
ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو لفحص كل دفعة من الأجنة. تحديد مظهر مبهم وإزالتها كأجنة غير مخصبة أو ميتة. إبقاء الأجنة في 28.5 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، فحص الأجنة تحت مجهر ستيريو وإزالة أي أجنة غير صحية أو ميتة. استخدام بعناية ماصة معجنات لنقل جنين واحد في كل بئر من 24 بئر. تأكد من أن كل بئر تحتوي على ما يكفي من E3 المتوسطة لتغطية الأجنة.
أخرج القنينات التي تحتوي على مركبات مثبطات مخزنة عند 4 درجات مئوية في الثلاجة. استخدام توازن تحليلي لوزن كمية مناسبة من المجمع، وإعداد 250 ميكرولترات من 100 ميل الأسهم ميليمولر لكل مركب في E3 المتوسطة أو آخر المذيب المناسب. ثم استخدم E3 المتوسطة لجعل التخفيفات التسلسلية من حلول المخزون على أساس مستويات السمية في أنابيب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
من الآبار التي تحتوي كل منها على جنين واحد من DPF، استخدم ماصة باستور وماصة ملليلتر لإزالة الماء E3 صف واحد في وقت واحد. توزيع على الفور 1 ملليلتر من كل مزيل من حلول الأسهم في آبار 24 بئر لوحة بدءا من انخفاض والانتقال إلى أعلى تركيز. بالنسبة لمجموعات التحكم، أضف مياه E3 أو مذيب آخر ذي صلة.
تسمية 24 لوحات جيدا مع اسم وتركيز المجمع والحفاظ على لوحات في 28.5 درجة مئوية في حاضنة. الحرص على أن المخففات من المواد الكيميائية في الآبار لا تتبخر في الحاضنة عن طريق ختم الجانبين من 24 لوحة جيدا. بعد 24 ساعة من التعرض للمركبات الكيميائية ، استخدم ماصة البسترة لنقل اليرقات المعرضة لكل تركيز من المجمع في طبق بتري صغير يحتوي على 3٪ من السليلوز الميثيل الجزيئي عالي الوزن.
مع مسبار معدني، ضعه جانبية. ضع طبق بتري تحت مجهر ستيريو متصل بكاميرا. التقاط الصور وحفظ الصور في مجلد منفصل كل يوم حتى نهاية التجربة.
أدخل كافة الملاحظات في جدول كل يوم إما في جدول عبر إنترنت أو على ورقة مطبوعة. بالنسبة للتعرض للمركبات السمة العصبية، قد تظهر يرقات DPF الأربعة إلى الخمسة نمط سباحة غير طبيعي. في هذه الحالة ، قم بعمل سجل لهذه التغييرات عن طريق التقاط فيديو قصير من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة لليرقات.
بعد خمسة أيام من التعرض للمركبات الكيميائية، لاحظ التركيز الذي يموت نصف الأجنة حيث التركيز المميت النصف الأقصى 50 من كل مادة كيميائية. بناء منحنى لوفيات الأجنة لجميع التركيزات باستخدام برنامج مناسب. في هذا البروتوكول، الجزء الحاسم من تقييم السمية هو اختبار تركيزات مختلفة من مركب كيميائي واحد أو عدة مركبات في تجربة واحدة.
بالنسبة للمركبات التي تحفز أي عيوب في شكلية في اليرقات ، تم تسجيل العيوب كل 24 ساعة على مدى فترة من يوم إلى خمسة أيام بعد التعرض للمواد الكيميائية. الأجنة تعامل مع مثبطات بيتا CA بتركيزات 250 ميكرومولار و 125 micromolar يحمل مختلف العيوب الظاهرية مقارنة مع عنصر التحكم. على سبيل المثال ، الأجنة غير المهزوزة حتى في اليوم الثالث ، بنية الجسم المنحنية ، كيس الصفار غير المستخدم والوذمة المتجانسة ، وعدم وجود كيس أوثيث في اليرقات في خمسة أيام بعد العلاج.
في دراسة أخرى، وأظهرت الأجنة تعامل مع مثبطات CA عدم وجود الحويصلات أوتوليث والمثانة السباحة. حددت التجارب مركبًا تمثيليًا للانهيدراس الكربوني 9 ، الذي تسبب في حدوث تغييرات ظاهرية بسيطة أو معدومة أثناء التطور الجنيني عند 500 ميكرومولار. أظهر المركب تركيز LC50 مرتفعًا.
ومع ذلك ، في مقارنة مع السيطرة ، وجد أن نفس المركب في 300 ميكرومولار هو سم عصبي ويستحث ترنح في اليرقات بعد خمسة أيام من التعرض. نوعية جيدة من الأجنة مهمة لفحص سمية المواد الكيميائية. للحصول على أجنة ذات نوعية جيدة، استخدم زوجًا صغيرًا من الحمار الوحشي البالغ للتكاثر.
ويمكن للمركبات التي تظهر آمنة أن تتميز كذلك من خلال أداء ذات الصلة في المختبر وفي التجارب الحية. في مجال تطوير الأدوية المضادة للترسبات ، ساعدت هذه التقنية على إعداد المزيد من التجارب لتثبيط الميتريا الميكوبتيري في زمرة الحمار الوحشي. وينطوي البروتوكول على استخدام مواد كيميائية قد تكون سامة للبشر.
وينبغي للأشخاص المشاركين في التجارب أن يأخذوا العناية المناسبة عند تناول المواد الكيميائية.
