Los procedimientos de prueba de toxicidad serán demostrados por el Dr. Ashok Aspatwar, un investigador senior de mi laboratorio. Nuestro protocolo identifica los efectos fuera del objetivo y detecta los efectos tóxicos sutiles de los productos químicos en la fase temprana del descubrimiento que pueden perderse en el cultivo celular u otros modelos animales. Las principales ventajas de nuestra técnica son: es rápida y eficiente, requiere una cantidad muy pequeña de productos químicos, y las instalaciones básicas en el laboratorio.
El cribado de toxicidad nos ayudará a decidir la concentración para estudiar su eficiencia frente a la micobacterium que causa la tuberculosis y para un mayor cálculo preclínico. Este método utiliza información sobre los efectos fuera de la diana de los productos químicos, y por lo tanto este método se puede utilizar en cualquier área de investigación donde la toxicidad de los productos químicos es de importancia primaria. Este método es muy simple y puede ser llevado a cabo por cualquier persona sin experiencia previa.
Individuos sin experiencia deben planificar el experimento cuidadosamente y utilizar un solo compuesto. Este método proporciona efectos tóxicos de los productos químicos en forma de cambios fenotípicos en los embriones de pez cebra en desarrollo y por lo tanto la seguridad de los compuestos probados. Para empezar, coloque de dos a cinco peces cebra macho adulto y de tres a cinco hembras adultas de pez cebra en tanques de apareamiento durante la noche.
Por la mañana, encienda la luz ya que la cría es inducida por el ciclo de luz automático oscuro y posterior. Para evitar el estrés a los animales, deje que los animales descansen durante dos semanas antes de usar los mismos individuos para la cría. Al día siguiente, antes del mediodía, recoger los embriones utilizando un colador de malla fina, y transferirlos a un plato de petri que contiene el medio embrionario E3.
Coloque el plato de petri bajo un microscopio estéreo para examinar cada lote de embriones. Identifique la apariencia opaca y retírelas como embriones no fecados o muertos. Mantenga los embriones a 28,5 grados centígrados en una incubadora durante la noche.
A la mañana siguiente, examine los embriones bajo un microscopio estéreo y retire los embriones insalubres o muertos. Utilice cuidadosamente una pipeta pasteur para transferir un embrión a cada pozo de una placa de 24 pozos. Asegúrese de que cada pozo contenga suficiente medio E3 para cubrir los embriones.
Saque los viales que contienen compuestos inhibidores almacenados a 4 grados centígrados en un refrigerador. Utilice un equilibrio analítico para pesar la cantidad adecuada del compuesto y prepare 250 microlitros de 100 soluciones de stock milimolar para cada compuesto en medio E3 u otro disolvente adecuado. A continuación, utilice el medio E3 para realizar diluciones en serie de las soluciones de stock basadas en los niveles de toxicidad en tubos de centrífuga de 15 mililitros.
De los pozos que cada uno contiene un embrión DPF, utilice una pipeta pasteur y una pipeta de 1 mililitro para eliminar el agua E3 una fila a la vez. Distribuya inmediatamente 1 mililitro de cada diluyente de las soluciones de stock en los pozos de la placa de 24 pozos a partir de una menor y pasando a una mayor concentración. Para los grupos de control, añada agua E3 u otro disolvente relevante.
Etiqueta 24 placas de pozo con el nombre y la concentración del compuesto y mantén las placas a 28,5 grados centígrados en una incubadora. Tenga cuidado de que los dilutantes de los productos químicos en los pozos no se evaporan en la incubadora sellando los lados de la placa de 24 pozos. Veinticuatro horas después de la exposición de los compuestos químicos, utilizar una pipeta pasteur para transferir las larvas expuestas a cada concentración del compuesto en un pequeño plato de petri que contiene 3% de peso molecular alto de celulosa metilo.
Con una sonda de metal, acuéndola de lado. Coloque el plato petri debajo de un microscopio estéreo conectado a una cámara. Tome las imágenes y guarde las imágenes en una carpeta independiente cada día hasta el final del experimento.
Introduzca todas las observaciones de una tabla cada día en una tabla en línea o en una hoja impresa. Para la exposición a compuestos neurotóxicos, las larvas de cuatro a cinco DPF pueden mostrar un patrón de natación anormal. En ese caso, haga un registro de tales cambios capturando un breve vídeo de 30 segundos a un minuto de las larvas.
Después de cinco días de exposición a los compuestos químicos, tenga en cuenta la concentración a la que la mitad de los embriones mueren como la concentración letal media máxima 50 de cada producto químico. Construir una curva para la mortalidad de embriones para todas las concentraciones utilizando un programa adecuado. En este protocolo, la parte crítica de la evaluación de la toxicidad es probar diferentes concentraciones de uno o varios compuestos químicos en un solo experimento.
Para los compuestos que inducen cualquier defecto fenotípico en las larvas, los defectos se registraron cada 24 horas durante el período de uno a cinco días después de la exposición al producto químico. Los embriones tratados con inhibidores de la BETA CA a concentraciones de 250 micromolares y 125 micromolares presentan varios defectos fenotípicos en comparación con el control. Por ejemplo, embriones no rayados incluso en el día 3, estructura corporal curvada, saco de yema no utilizada y edema pericárdico, y ausencia de sacos de otolito en las larvas a los cinco días después del tratamiento.
En otro estudio, los embriones tratados con inhibidores de CA mostraron la ausencia de sacos de otolito y vejiga de natación. Los experimentos identificaron un compuesto representativo de anhidrasa carbónica 9, que indujo cambios fenotípicos mínimos o no durante el desarrollo embrionario a 500 micromolares. El compuesto mostró una alta concentración de LC50.
Sin embargo, en comparación con un control, se encontró que el mismo compuesto a 300 micromolares era neurotóxico e indujo ataxia en las larvas después de cinco días de exposición. La buena calidad de los embriones es importante para el cribado de toxicidad de productos químicos. Para obtener embriones de buena calidad, utilice un par joven de peces cebra adultos para la cría.
Los compuestos que emergen como seguros pueden caracterizarse aún más por la realización de experimentos in vitro e in vivo relevantes. En el campo del desarrollo de fármacos antituberculosos, esta técnica ayudó a establecer nuevos experimentos para la inhibición in vivo de micobacterium marinum en embriones de pez cebra. El protocolo implica el uso de sustancias químicas que pueden ser tóxicas para los seres humanos.
Las personas involucradas en los experimentos deben tener el cuidado adecuado al manipular los productos químicos.
