Les procédures d’essai de toxicité seront démontrées par le Dr Ashok Aspatwar, chercheur principal de mon laboratoire. Notre protocole identifie les effets hors cible et détecte les effets toxiques subtils des produits chimiques dans la phase précoce de la découverte qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d’autres modèles animaux. Les principaux avantages de notre technique sont: il est rapide et efficace, nécessite très petite quantité de produits chimiques, et les installations de base dans le laboratoire.
Le dépistage de la toxicité nous aidera à décider de la concentration pour étudier son efficacité contre la mycobactérie qui cause la tuberculose et pour d’autres calculs précliniques. Cette méthode utilise un aperçu des effets hors cible des produits chimiques, et donc cette méthode peut être utilisée dans n’importe quel domaine de recherche où la toxicité du produit chimique est d’une importance primordiale. Cette méthode est très simple et peut être effectuée par n’importe qui sans expérience préalable.
Les personnes qui n’ont aucune expérience devraient planifier l’expérience avec soin et utiliser un seul composé. Cette méthode fournit des effets toxiques des produits chimiques sous la forme de changements phénotypiques dans les embryons de poisson zèbre en développement et donc la sécurité des composés testés. Pour commencer, placez deux à cinq poissons zèbres mâles adultes et trois à cinq poissons zèbres femelles adultes dans des réservoirs d’accouplement pendant la nuit.
Le matin, allumez la lumière car la reproduction est induite par le cycle de lumière automatique sombre et subséquent. Pour éviter de manipuler le stress pour les animaux, laissez les animaux se reposer pendant deux semaines avant d’utiliser les mêmes individus pour la reproduction. Le lendemain avant midi, recueillir les embryons à l’aide d’une passoire à mailles fines, et les transférer sur une boîte de Pétri contenant e3 milieu embryonnaire.
Placez la boîte de Pétri sous un microscope stéréo pour examiner chaque lot d’embryons. Identifiez l’apparence opaque et retirez-les comme embryons non fécondés ou morts. Gardez les embryons à 28,5 degrés Celsius dans un incubateur pendant la nuit.
Le lendemain matin, examinez les embryons au microscope stéréo et enlevez les embryons malsains ou morts. Utilisez soigneusement une pipette pasteur pour transférer un embryon dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Assurez-vous que chaque puits contient suffisamment de milieu E3 pour couvrir les embryons.
Sortez les flacons contenant des composés inhibiteurs conservés à 4 degrés Celsius dans un réfrigérateur. Utilisez un équilibre analytique pour peser la quantité appropriée du composé, et préparer 250 microlitres de solution de stock de 100 millimolaires pour chaque composé dans le milieu E3 ou un autre solvant approprié. Ensuite, utilisez le milieu E3 pour faire des dilutions en série des solutions de stock basées sur les niveaux de toxicité dans des tubes de centrifugeuse de 15 millilitres.
Dans les puits qui contiennent chacun un embryon de DPF, utilisez une pipette pasteur et une pipette de 1 millilitre pour enlever l’eau E3 une rangée à la fois. Distribuez immédiatement 1 millilitre de chaque diluant des solutions de stock dans les puits de la plaque de 24 puits à partir de la baisse et en passant à une concentration plus élevée. Pour les groupes de contrôle, ajouter de l’eau E3 ou un autre solvant pertinent.
Étiquetez 24 plaques de puits avec le nom et la concentration du composé et gardez les plaques à 28,5 degrés Celsius dans un incubateur. Faites en sorte que les diluants des produits chimiques dans les puits ne s’évaporent pas dans l’incubateur en scellant les côtés de 24 plaques de puits. Vingt-quatre heures après l’exposition des composés chimiques, utiliser une pipette pasteur pour transférer les larves exposées à chaque concentration du composé dans une petite boîte de Pétri contenant 3% de poids moléculaire élevé cellulose méthylique.
À l’insurgie d’une sonde métallique, mentent-la latéralement. Placez la boîte de Pétri sous un microscope stéréo attaché à une caméra. Prenez les images et enregistrez les images dans un dossier séparé chaque jour jusqu’à la fin de l’expérience.
Entrez toutes les observations dans une table chaque jour, que ce soit dans une table en ligne ou sur une feuille imprimée. Pour l’exposition aux composés neurotoxiques, les quatre à cinq larves de DPF peuvent présenter un modèle de nage anormal. Dans ce cas, faites un enregistrement de ces changements en capturant une courte vidéo de 30 secondes à une minute des larves.
Après cinq jours d’exposition aux composés chimiques, notez la concentration à laquelle la moitié des embryons meurent comme la concentration létale à moitié maximale 50 de chaque produit chimique. Construire une courbe pour la mortalité des embryons pour toutes les concentrations à l’aide d’un programme approprié. Dans ce protocole, la partie critique de l’évaluation de la toxicité est de tester différentes concentrations d’un ou plusieurs composés chimiques dans une seule expérience.
Pour les composés qui induisent des défauts phénotypiques chez les larves, les défauts ont été enregistrés toutes les 24 heures sur la période d’un à cinq jours après l’exposition au produit chimique. Les embryons traités avec des inhibiteurs bêta-CA aux concentrations de 250 micromolaires et 125 micromolaires présentent divers défauts phénotypiques par rapport au contrôle. Par exemple, les embryons non chichés même au jour 3, la structure incurvée du corps, le sac jaune non utilisé et l’oedème péricardique, et l’absence de sacs otolithes chez les larves à cinq jours après le traitement.
Dans une autre étude, les embryons traités avec des inhibiteurs de CA ont montré l’absence des sacs d’otolithe et de la vessie natatoire. Les expériences ont identifié une anhydrase carbonique composée représentative 9, qui a induit des changements phénotypiques minimes ou nuls pendant le développement embryonnaire à 500 micromolaires. Le composé a montré une concentration élevée de LC50.
Cependant, dans une comparaison avec un contrôle, le même composé à 300 micromolar s’est trouvé pour être neurotoxic et ataxie induite dans les larves après cinq jours d’exposition. La bonne qualité des embryons est importante pour le dépistage de la toxicité des produits chimiques. Pour obtenir des embryons de bonne qualité, utilisez la jeune paire de poisson zèbre adulte pour la reproduction.
Les composés qui apparaissent comme sûrs peuvent être encore caractérisés en effectuant des expériences in vitro et in vivo pertinentes. Dans le domaine du développement de médicaments antituberculose, cette technique a permis de mettre en place d’autres expériences pour l’inhibition in vivo du mycobactérie marinum chez les embryons de poisson zèbre. Le protocole implique l’utilisation de produits chimiques qui peuvent être toxiques pour les humains.
Les personnes impliquées dans les expériences doivent prendre soin de manipuler les produits chimiques.
