هذه الطريقة من solubilizing الحرير العنكبوت المؤتلف تنتج أشكال المواد التي لا يمكن استخدام المذيبات العضوية القاسية التقليدية. علاوة على ذلك ، فإن العملية هي الحبوب ، مما يؤدي إلى محلول بروتين بسيط في الماء. باستخدام هذه الطريقة، والمواد التي شكلت أو المنتجة الحفاظ على الخصائص المرغوب فيها من البروتينات الحريرية العنكبوت.
هذه التقنية solubilization لالحرير العنكبوت المؤتلف يسمح ل solubilization من الحرير العنكبوت المؤتلف في عملية خطوة واحدة. وهذا أمر مرغوب فيه لأن هذه المعروف من الصعب إنتاج البروتينات لا تضيع من خلال المعالجة واسعة النطاق. علاوة على ذلك، بما أن الحلول هي مجرد بروتين في الماء، يمكن إضافة مركبات أخرى نشطة بيولوجيا إذا كان ذلك مرغوباً فيه للتطبيق.
خاصة, العلاقة وظيفة هيكل البروتين, هذا النظام هو memetic لكيفية العنكبوت يجعل الألياف في أنه يستخدم الماء والبروتينات بتركيز عال. باستخدام هذا الأسلوب solubilization وتشكيل المواد اللاحقة، ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على فهم في المواد التي يتم تشكيلها، والهياكل التي هي المسؤولة عنها. ويعتقد أنه يمكن أن يكون، لقد استخدمنا هذه التقنية ل solubilizing الببتيدات الاصطناعية التي لولا ذلك تتطلب بيئة قلوية أو حمضية لحلها.
يمكن أن يكون مفيدا في التطبيقات المصب لتلك الببتيدات. وعلاوة على ذلك، يميل عدد من البروتينات المعروفة عندما يتم التعبير عنها صناعياً إلى أن ينتهي بها المطاف في الكسر غير القابل للذوبان. إعادة الذوبان، ومن ثم إعادة تقليد هذه البروتينات غالبا ما تكون عملية شاقة أن يؤدي إلى خسائر كبيرة.
باستخدام هذه التقنية، قد يكون من الممكن زيادة كفاءة عمليات الاسترداد للبروتينات غير القابلة للذوبان. وضع قارورة مختومة في الميكروويف هو شاقة بعض الشيء إعطاء خطر ارتفاع درجة الحرارة وبالتالي أكثر من الضغط على القارورة. فهم نهج مرحلي لتطبيق الحرارة والضغط أمر بالغ الأهمية.
ثانياً، بالنسبة لحرير العنكبوت المؤتلف على وجه الخصوص، فإن وجود الملح الحالي لن يسمح لهذه التقنية بالعمل أو العمل بفعالية اعتماداً على كمية الملح الموجودة. إزالة الملح هو المفتاح. كن صبوراً وحذراً، راقب عن كثب أوقات الميكروويف ودرجات الحرارة داخل القارورة.
وهو أمر بالغ الأهمية لأن هناك عددا من الأجزاء المتحركة للتشغيل التي غالبا ما يصعب نقلها من خلال المواد المكتوبة التقليدية وأقسام الأسلوب. وبالنظر إلى أن هناك العديد من البروتينات التي لديها مشاكل في الذوبان التي تمنع الدراسة الكافية، فإن هذه الطريقة يمكن تطبيقها عبر مجموعة متنوعة من مساحات البروتين لتحسين، أو حتى السماح بالتقنيات التحليلية وتوصيف الخواص. للبدء، حدد قارورة زراعة الزجاج البورسليكات القابلة للانفلات القابلة للانفلات النظيفة والجديدة بثمانية ملليلتر مع غطاء برغي مبطن بالمطاط، ووضع القارورة الفارغة على توازن تحليلي.
المسيل للدموع كتلة من القارورة فارغة بحيث يقرأ التوازن كتلة الصفر. إضافة مسحوق بروتين حرير العنكبوت المُعَدّد المُعَدّد المُنْتَبَدِي إلى القارورة الفارغة للمادة المحددة. ثم، إضافة الكمية المطلوبة من الماء النقي جدا، على الأقل ملليلتر، إلى القارورة.
ختم غطاء القارورة، ودوامة سريعة محتويات لخلق خليط بروتين الحرير العنكبوتي المعمّق والمشتّتة والمجائد. إجراء فحص نهائي للغطاء القارورة للتأكد من أنه تم تشديد بحزم وأمان. ثم، نقل مع وقفل خليط بروتين حرير العنكبوت المؤتلف إلى فرن الميكروويف التقليدية مع مجموعة من الطاقة 700 إلى 1500 واط.
بدء تشغيل الميكروويف مع خمس رشقات ثانية تعيين السلطة الكاملة عن طريق التبديل يدويا وإيقاف تشغيله. بعد كل انفجار، وفتح الباب لفترة وجيزة، وخلط بعناية القارورة لمنع الاستقرار، والحفاظ على الخليط المعلقة. تسمح أحيانا القارورة والحل لتبرد، ومنع الحل فائقة من لمس الختم.
استخدم ميزان حرارة الأشعة تحت الحمراء لقياس درجة حرارة المحلّل الذي يحتوي على جزء من القارورة. كرر عملية الميكروويف حتى تصل درجة الحرارة إلى 130 درجة مئوية على الأقل، وتم حل جميع الجسيمات الصلبة بالكامل. ثم، والسماح لدرجة حرارة المحلول وغطاء القارورة لتبرد أقل من 100 درجة مئوية.
قبل أن يتم تبريد هذا الحل بالكامل، يلقي به من القارورة إلى هندسات محددة لتشكيل هيدروجيل. بعد تشكيل الهيدروجيل، وضعه في حمام مائي، ونقله إلى الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية. انتظر حتى يتم تجميد الحمام تماما.
أكمل عملية تكوين الإسفنج عن طريق إزالة هيدروجيل المجمدة وحمام الماء من الفريزر، والذوبان في 25 درجة مئوية. ثم، إزالة الإسفنج الناتجة من الماء المذاب. لإعداد lyogel، نقل عينة هيدروجيل المجمدة إلى مزيل تحلل.
بعد 24 ساعة، وإزالة المواد هلام الزنجي النهائي من السفينة. لإنتاج أفلام من بروتين حرير العنكبوت المؤتلف ، يلقي 200 ميكرولترات من بروتين حرير العنكبوت المؤتلف الساخن من القارورة على شكل PDMS للشكل المطلوب. بعد أن يتم تجفيفها، قشر قبالة الركيزة PDMS للاختبار أو العلاج.
لإعداد طلاء لا يمكن إزالته من الركيزة، استخدم بخاخ البخاخة لتطبيق البروتين الحرير العنكبوتي المؤتلف لإجراء طلاء رذاذ أولي على الركيزة من الاختيار. بعد أن يتم تجفيفها، غمر الركيزة المغلفة في بروتين الحرير العنكبوت المأتلف المندمج لتشكيل طلاء تراجع. كرر طلاء تراجع لتحقيق سمك المطلوب.
لتشكيل مواد لاصقة، استخدم ماصة لإضافة بروتين حرير العنكبوت المؤتلف على الركيزة، ثم قم بتطبيق الركيزة الثانية على الجزء العلوي من المحلل. المشبك بحزم القطع معا، ثم تجفيف العينات في فرن مع درجة حرارة أدنى من 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل. لتوليد ألياف نسج الرطب، واستخدام إبرة 19 مقياس انسل، وتحميل محلول مخدر solubilized في حقنة متحدة المركز مع طرف قفل Luer.
قذف فقاعات الهواء، والسماح للمبيد الجلوس في نهاية قفل لور من الحقنة. إدراج ما لا يقل عن 25 ملليمترا من أنابيب PEEK في الأنابيب PEEK قطعة واحدة تركيبات ضيقة إصبع واحد لأكثر من 16 بوصة القطر الخارجي، و 10 أكثر من 32 مشط. استبدال إبرة قياس 19 مع هذا الإعداد على محول Luer قفل الإناث من الحقنة.
ثم، وضع قفازات نيتريل على السطح الخارجي من godets المتوسطة، للحفاظ على الألياف التي سيتم إنشاؤها من الانزلاق، وتجنب إتلاف المحركات. الحصول على حمام زجاجي واضح طويل القامة مع 99٪ نقية isopropanol لاستخدامها كحمام التخثر. ملء أول حمام تمتد بنسبة 80 إلى 20 من ايزوبروبانول والمياه المقطرة.
في حمام التمدد الثاني، املأ نسبة 20 إلى 80 من الأيزوبروبانول والماء المقطر. قم بإعداد نظام التمدد على الكمبيوتر. لضبط السرعة الرئيسية لإزالة الألياف، ضبط شريط انزلاق ل godet الثلاثي سرعة إلى قيمة تتراوح بين 10 إلى 14 ملليمتر في الثانية الواحدة، اعتمادا على مدى سرعة الألياف وتشكيل.
بدء تمتد الأولى عن طريق تحريك شريط انزلاق من الثلاثي godet B نسبة تمتد إلى اثنين ل godet النهائي في حمام تمتد واحد, godet العلوي الأوسط, وأول godet في حمام تمتد اثنين. بدء تمتد الثانية عن طريق تحريك شريط انزلاق من الثلاثي godet C نسبة تمتد إلى اثنين ل godet النهائي في حمام تمتد اثنين، godet العليا الأخيرة، وواصف. يضمن هذا الإعداد أن أول godet بعد حمام التخثر، وأول godet في حمام التمدد الأول تدور بنفس السرعة.
المقبل، تحميل حل الحرير في حقنة من آلة مخصصة خط تدور. في النظام الآلي، تعيين معدل البثق إلى 10 ملليمترات في الثانية الواحدة، من أجل قذف حل الحرير في حمام التخثر الزجاجي مليئة ايزوبروبانول. السماح للبثق الألياف لتصبح موحدة، قبل سحب الألياف من الحمام مع ربط المعادن رقيقة.
تحقق من أن إزالة الألياف من الحمام يخلق حلقة بين طرف أنابيب PEEK ومسار الألياف مغادرة الحمام. دليل الألياف المستردة من خلال سلسلة من godets، بحيث يتم غمر الألياف في الحمامات تمتد، ولكن التجفيف في الهواء بين حمامات تمتد، وقبل الذهاب إلى بكرة. في هذا البروتوكول من خلال solubilization من البروتين الحرير العنكبوت المؤتلف، يمكن تحقيق مجموعة متنوعة من الأشكال المادية.
يتم تقديم سبعة أشكال مادية هنا. الهيدروجيل، lyogels، الإسفنج، المواد اللاصقة، الطلاء، والأفلام، والألياف. الألياف تتطلب المعالجة الأكثر شمولا عن طريق البثق في حمام تخثر، ومن ثم تمتد تسلسليا الألياف الخام في حمامات التمدد بعد بن.
وبالنظر إلى أن البروتين والمياه حلول ساخنة لدرجة حرارة عالية نسبيا والضغط، وقد تجربتنا هي أن الحلول معقمة عند النقطة يتم حل البروتين. وهذا يسمح لأي من الأشكال المادية المعروضة هنا أن تؤخذ إلى ثقافة الخلية، طالما أنها يتم التعامل معها بشكل مناسب، لدراسة استجابة الخلوية للمواد. وقد أدت هذه التقنية بالتأكيد إلى اكتشاف أشكال مواد جديدة، بما في ذلك المواد اللاصقة والمواد الإسفنجية.
أشكال المواد التي ليست موجهة بالضرورة نحو تشكيل الألياف، على الرغم من تشكيل الألياف هي واحدة من المناطق التي شهدت أيضا تحسنا من خلال تطوير هذه التقنية. توليد الحرارة والضغط داخل قارورة مختومة لديه خطر متأصل. دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية عند تنفيذ هذه الإجراءات.
