بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة K08EY015829، R21EY019561، R24EY015656، P41 EB002520، وR01 EY020856 بحوث لمنع العمى جائزة التطوير الوظيفي، وثلاثي المؤسسية مبادرة الخلايا الجذعية. HCLE خط خلية قدمت مجاملة من الدكتور إيلين Gipson. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Aihong ليو في كلية طب وايل كورنيل للحصول على المساعدة التقنية والتوجيه لها مع ثقافة الخلية، أنتوني Labissiere في مستشفى الجراحات الخاصة للحصول على المساعدة التقنية لها مع التصوير ووزارة شؤون المرأة، المورد مركز هندسة الأنسجة (TERC) في جامعة تافتس للدعم التقني مع التطور المادي، ومركز كورنيل للعلوم النانومترية الحجم ومرفق التكنولوجيا (كنف) للمساعدة في تصنيع رقاقة السيليكون.

1. تصنيع قوالب مطاط السيليكون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج أو شراء سطح المطلوب الطبوغرافية لالصب. سيكون لهذا المنشور يمكن وصفها على مستوى 100 ​​ملم رقاقة السيليكون محفورا (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج polydimethylsiloxane (PDMS) بوتينغ (مكون ألف) والمحفز (B عنصر) حل في نسبة 01:09 (9 ز بوتينغ و 1 محفز ز) على النحو المنصوص عليه في المجموعة التي تم شراؤها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج حلول شاملة للشروع في عملية المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان سطح رقاقة السيليكون داخل صحن الصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن من 4.5 غرام من حل PDMS على رقاقة السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتشار PDMS حل لتغطية يبلغ قطرها 100 ملم منطقة من سطح رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إمالة رقاقة لنشر PDMS حل بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية رقاقة مع 100 غطاء القطر مم طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان صب الإعداد إلى 60 درجة مئوية الفرن طوال الليل، مما يجعل من المؤكد أن المعالجة تجري على سطح مستو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان علاجه PDMS / رقاقة السليكون إلى إيثانول 70٪حمام قبل إزالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء إزالة PDMS من رقاقة باستخدام شفرة حلاقة لرفع حافة (محيط بأكمله) 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برفق PDMS قبالة باستخدام ملقط داخل حمام الايثانول 70٪ والحرص على عدم المسيل للدموع سيليكون صب المطاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة خارج القوالب PDMS الفردية باستخدام 14 لكمة ثقب ملم. تم تصميم هذا القطر لتتناسب مع الإعداد لوحة 24-جيدا. </li></ol> 2. انتاج الحرير الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب 2 لتر من الماء المقطر (DH 2 O) ليغلي داخل كوب زجاج 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 5 غ من شرانق دودة القز Bombyx موري إلى الثلثين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من الشرانق الملوثة على نطاق واسع كما هو مبين من قبل المفرط حشرة الجسيمات طلاء السطح الداخلي شرنقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 4.24 غرام من كربونات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم ببطء إلى الغليان درهم حجم O 2 لمنع يغلي الماء، والسماح للتفكك التام قبل الشروع في الاستمرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى قطع شرنقة درهم غليان <suب&gt; 2 O لمدة 40 دقيقة، واستخدام شريط تفلون المغلفة لاثارة ضجة شرانق خلال عملية الغليان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغليان، واستنزاف بعناية درهم 2 O في الحوض وخاتم من استخراج الحرير باليد لإزالة المياه الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الحرير استخراج ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة. كل في 1 لتر من DH 2 O في كوب مختبر، واستخدام بقضيب أن تعمم في حجم كوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل، وحلقة من استخراج الحرير من جهة، وانتزاع مكان الألياف الحريرية داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية للسماح لتجفيف الموارد البشرية 12. فترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، والموازنة بين ألياف الحرير المجفف، والذي هو عادة ~ 3.5 غرام: ___________-G </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 9.3 حل LiBr M للتوصل الى حل وزن / 20٪ من الحرير. الاستفادة من المعادلات التالية لحساب الوزن الضرورية ومجلدات: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (مقتطف من الحرير الوزن الخطوة 10) × (4) = ___________ ملليمترا من مجموع 9،3 حل LiBr M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [(807.705) × (LiBr حجم جزء من 11.a)] / 1000 = ___________ غرام من LiBr إضافة إلى DH 2 O </li></ol> &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قياس الوزن LiBr في كأس زجاج من حجم درهم التالية O 2: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (0.8) × (حجم محسوب من الخطوة 11.a) = ___________ مل من DH 2 O </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب هذا الحل الى الحجم المناسب وتخرج اسطوانة، وتقديم حل ما يصل إلى الحجم النهائي وفقا لحسابات في جزء 11.a. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستخلص الحرير في دورق وتصب حل LiBr على ألياف الحرير التأكد مغمورة ألياف الحرير في حل LiBr باستخدام ملعقة مختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحرير المنحل إلى 60 درجة مئوية الفرن لمدة 4 الموارد البشرية: وقت البدء: ___________ نهاية الوقت: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام محقنة الحجم المناسب وضع 12 مل من محلول الحرير. تضع إبرة 18G في نهاية حقنة، وحقن ثم حل في كاسيت لغسيل الكلى (3،500 ميغاواط coutoff، الشرائح-A-Lyzer، الحرارية العلمية). بعد ملء كاسيت، ورسم في الهواء المتبقية للخروج من كاسيت مع المحقنة يفرغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان فايlled كاسيت لغسيل الكلى في 1 لتر من DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير درهم حجم O 2 بعد 1 ساعة، ساعة 4 و 8 و ساعة ثم كل ساعة 12 3X ليصبح المجموع 6 التغييرات: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1hr: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4hr: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 ساعات: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ساعة: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ساعة: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 ساعة: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهاية: ___________ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسيل الكلى، وجمع ببطء حل الحرير من أشرطة الكاسيت مع حقنة. حل مكان إلى 10000 أنابيب ز الطرد المركزي في التصنيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الحل مرتين في 10000 ز في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، كل. بعد كل مكان طاف الطرد المركزي في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن حل الحرير عبتي في الثلاجة 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 عينات من 0.5 ملم في حل الحرير تزن طبق صغير، ومكان وزن أطباق داخل 60 درجة مئوية فرن جاف لمدة 12 ساعة أو حتى يجف حل الحرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن ما تبقى من فيلم الحرير متين من بوتح عينات لقياس الوزن في المئة من الحرير حل لتركيز بروتين حجم: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوزن من مجموع 2 عينات فيلم الحرير: ___________ ملغ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (وزن من 23.a) × (100) = الحرير ___________٪ </li></ol></li></ol> 3. إعداد أفلام الحرير والثقافة إعداد النظام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير السطوح الصب PDMS عن طريق تنظيف مع شريط واضح لإزالة الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة PDMS ركائز عن طريق نقع في EtOH 70٪ وغسل ثلاث مرات مع DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 14 ملم قوالب PDMS على لوحة حامل، وهو عادة من 24 لوحة غطاء جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج فيلم ميكرون 50 سميك، ينتشر 70 μls من حل الحرير 8٪ في قوالب PDMS باستخدام أداة سائل الانتشار التي هي عادة حقنة 1 مل نصيحة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأفلام الحرير لتجف كشف على مقعد نظيفة تشغيل ضغط تدفق الهواء من 150 باسكال لمدة 90 دقيقة أو حتى الأفلام جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الأفلام هي مكان جاف كامل مجموعة من الأفلام، بما في ذلك م PDMSالأطفال الذين تتراوح أعمارهم، في غرفة المياه طهي للساعة 4&gt; لإنتاج فيلم المياه غير قابلة للذوبان. هذا هو عادة وغرفة مجفف فارغة بالماء في الجزء السفلي من حوض سحبت في فراغ كيلوباسكال 25 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأفلام الحرير من غرفة المياه الصلب ومكان على مقعد نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حمام EtOH 70٪ في غضون طبق بيتري 35 مم، وركائز سيطرة مكان (أي من الزجاج أو البلاستيك السطوح) وحلقات الفولاذ المقاوم للصدأ في الآبار للحصول على ما لا يقل عن 10 دقيقة لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأفلام الحرير من قوالب PDMS باستخدام ملقط، وتراجع لهم في EtOH 70٪، وعينة مكان إلى 24 صفيحة مملوءة مسبقا بشكل جيد مع 1 مل من EtOH 70٪ والتأكد من جانب نمط تواجه للسماح للالتصاق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع كل عينة فيلم الحرير في المقابل غير القابل للصدأ مكان جيد الأوزان حلقة من الصلب (11.65 مم القطر الداخلي، وقطره الخارجي 15.45 ملم، وسماكة 1،18 ملم) على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعينات مع حلقات لاحتضان لمدة 10 دقائق للتأكد من عقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريموهاء EtOH وتغسل كل عينة 3x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. يسمح لكل غسيل الجلوس لمدة 5 دقائق للسماح للنشر كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS باستخدام الشفط ماصة الزجاج، مع التأكد من إزالة معظم الفقاعات تحت عينات فيلم الحرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد خط خلية للبذار. كمثال على ذلك، يعرض للتريبسين القرنية، الحوفي الظهارية البشرية خط الخلية (HCLE) مع التربسين 0.25٪ وحمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل لدقيقة-7. وأضاف تنشيط التربسين باستخدام 01:01 حجم النسر Dulbecco والمتوسطة معدلة (DMEM) وسائل الاعلام مع مرور FBS 10٪. منبذة الخلايا HCLE trypsinized، إضافة 8 مل من خلية كيراتينية-المصل وسائل الإعلام الحرة (K-SFM) لتكوير الخلية، تستنهض الهمم بلطف لتفريق HCLEs، وتوليد عدد خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة 500 ميكرولتر من تعليق HCLE لكل بئر باستخدام عادة خلايا 10000 / سم 2 كثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافات مكان ضمن حاضنة عند 37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون (2) وبروتوكول تشغيل تجريبي المطلوب. </li></ol> 4. ممثل النتائج &lt;ف الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> الرسم البياني رقم التدفق 1. توضيح موجز 10 خطوة عملية لإنتاج فيلم الحرير وثقافة إعداد النظام. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> الشكل 2. (A) 21-صبغ مجموعة من طوبوغرافيات منقوشة سطح خط إنتاجها على رقاقة السيليكون بقطر 90 ملم التي تستخدم معيار تقنيات الحفر الطباعة التصويرية وجاف. (ب) الأفلام الحرير تحتفظ الأصلي ملامح خط مواز على غرار صب صب PDMS على السطوح. (C) تخطيطي حجم ميزة إظهار تصميم اختيار لتعزيز التوافق الخلوية. (د) قطاع عريض من الحرير فيلم يوضح الاحتفاظ اصطف مواز سطح منقوشة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> الشكل 3. مسح الميكروسكوب الالكتروني من خط خلية HCLE الالتزام (A) منقوشةو (ب) الأفلام الحرير شقة في يوم 2 في الثقافة. الثقافات HCLE تستمر في الانتشار إلى التقاء على (C) ونقش (D) الأسطح المسطحة التي كتبها يوم 8 في الثقافة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> الشكل 4. (A، D، G) المزخرفة و(B، E، H) شقة ثقافة الأفلام الخلايا HCLE الحرير نسبيا إلى (C، F، I) ركائز السيطرة على الزجاج (AC) 1 يوم، (مدافع) يوم 4، و 8 ايام (GI) في الثقافة. (J) CyQuant محتوى الحمض النووي و(K) (3 - (4،5-Dimethylthiazol-2-يل) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT) فحص النشاط الأيضي بيانات تبين جدوى HCLE على كل نمط وشقة ركائز فيلم الحرير بالمقارنة مع أسطح التحكم الزجاج على مر الزمن (الحانات نطاق = 100 ميكرومتر). (فيديو 1). الفاصل الزمني المرحلة على النقيض من التصوير من الخلايا HCLE ترحيل أكثر من فيلم منقوشة سطح الحرير خلال ساعة 18. الفترة الزمنية. وفازت المصنفة الخلايا في كثافة 2 10k/cm وتربيتها لمدة 2 ساعة. قبل التصوير. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم</a> . فيديو 2. الفاصل الزمني المرحلة على النقيض من التصوير من الخلايا HCLE المهاجرة على سطح مستو مراقبة TCP خلال ساعة 18. الفترة الزمنية. وفازت المصنفة الخلايا في كثافة 2 10k/cm وتربيتها لمدة 2 ساعة. قبل التصوير. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

<ol>
	<li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin.">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , (2011).</li><li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features.">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li><li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+biomaterials.">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li><li>Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery.">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li><li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor.">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices.">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li><li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo.">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li><li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets.">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li><li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films.">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li><li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering.">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li><li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin.">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li><li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues.">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li><li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+&#x03B2;-Sheet+Content.">Water-Stable Silk Films with Reduced &#x03B2;-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li><li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties.">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization.">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin.">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45 (1964).</li><li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy.">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li><li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders.">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li><li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing.">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li><li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+route+for+silk.">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li><li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes.">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li><li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+at+a+distance:+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus.">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد اكتسب استخدام الأفلام الحرير مجدد باعتباره ركيزة للثقافة خلية في شعبية على مدى العقدين الماضيين نتيجة لتوصيف واسعة من الخصائص المادية لهذا البروتين وزيادة الفهم للمادة بيولوجية لها فائدة 3،8. نظام الثقافة وصفها هنا يمثل رواية في نظام الاختبار في المختبر لتقييم التفاعلات سطح الخلية على الحرير المزخرف ركائز بيولوجية فيلم 7. ويتيح هذا النظام في تحليل معمق لالتفاعلات الخلوية مع مرور الوقت التي يمكن اعتمادها بسهولة لجمع البيانات عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا إلى حد كبير لأن الأفلام الحرير امتلاك عدد من الخصائص مادة بيولوجية الانضباطي التي يمكن تعديلها لتؤثر بشكل مباشر على وظيفة الخلية 8،9،12، بما في ذلك: السيطرة على سطح مايكرو / نانو سطح تضاريس 7؛ كيمياء السطح المختلفة من خلال تعديل التساهمية أو الامتزاز من جزيئات بيولوجية نشطة 13؛ الميكانيكية قويanical خصائص 15،16، والرقابة على المواد hydrophilicity / hydrophobicity 16؛ تحميل الجزء الأكبر من المركبات البيولوجية للافراج 4،8،17، وانحلال للرقابة / معدلات التحلل الأنزيمي من خلال السيطرة على هيكل ثانوي (بيتا محتوى ورقة) 11،18،19 . ويتم تحقيق الشفافية في الأفلام الحرير من خلال الصلب الأفلام لفترة من الزمن في ظل فراغ في وجود بخار الماء 7،15. هذا النهج تجهيز يسمح لتشكيل β ورقة هيكل الثانوي، وتعزيز الذوبان من المواد في المياه في الوقت الذي تسمح حيود الحد الأدنى للضوء 15. هذه الشفافية من الأفلام هو مفتاح الحل في تمكين المباشرة الحية الخلية التصوير التي يمكن استخدامها في إطار عدد من طرائق التصوير (أي واسع المجال ومضان) باستخدام أي عدد من النظم مجهر 12،20. بالإضافة إلى التصوير الخلية الحية، ويمكن إزالتها بسهولة أفلام الحرير من اله نظام الثقافة للسماح لتثبيت إضافية وتحليلها. وهكذا، فإن مجموعة كبيرة ومتنوعة من التقييمات التجريبية المباشرة التي يمكن القيام بها في هذا النظام هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من الخلايا / الأنسجة مصادر لكثير من المجالات الفنية 3،8،9،12،13،21. في الوقت الفاصل بين نتائج التصوير توضيح كيف يمكن جمع البيانات ثقافة في الوقت الحقيقي، وكما استخدمت مثال لتوضيح كيفية تضاريس سطح الخلية يؤثر على التفاعلات. نتائج ممثل توضح كيف يمكن استخدام المواد الحيوية فيلم الحرير لدعم HCLE نمو الثقافة، وقابلة للتعديل لعدد من الانتشار الخلوي القياسية والمقايسات الأيض (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يتم إصلاح الثقافات ومعالجتها لمسح التصوير الإلكتروني أو غيرها من البروتوكولات (الشكل 3). ويتم إنتاج فيلم ركائز الحرير في المختبر مع الدقة العالية، والاتساق، وبتكلفة منخفضة نسبيا (الشكل 1) وهذا يتيح reproduciبيليتي في كل ثقافة إعداد النظام والنتائج التجريبية. وقد ثبت أن المياه يصلب معالجة تنتج فيلم الحرير مادة مستقرة داخل الثقافة التي حددت معدلات التدهور في انتظار تركيز البروتياز في حل 2،15،22. ونتيجة لذلك قد تستخدم هذه المواد لفترات طويلة من الوقت لزراعة الخلايا على المدى الطويل، أو لا تزال تزرع لشهور أو سنوات تبعا لموقع الفسيولوجية 8. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال الأخيرة أن كلا من بنية البروتين وخصائص المواد من الأفلام الحرير المياه صلب تتفق من حزمة إلى أخرى مما يسمح للنتائج ثقافة استنساخه كما هو مبين من خلال مختلف طرق الاختبار الميكانيكية والفيزيائية الحيوية 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت سطح المادة والاخلاص الكبير بين دفعات الفيلم كما هو مبين من قبل، ووزارة شؤون المرأة micrscopy القوة الذرية (فؤاد)، ودراسات ثقافة خلية {لورانس: 2008wr، Omenetto: 2008tc، براي: 2011kq} 7،23،24. مادة stabilإيتي والاتساق هو عامل مهم لكيفية خلية لن تشعر الركيزة ثقافة من خلال مسارات mechanotransduction مختلفة، وتنتج في نهاية المطاف الاستجابة المطلوبة / غير مرغوب فيها الخلوية 25،26. المعايير التاريخية لركائز الثقافة، مثل البلاستيك زراعة الأنسجة المعالجة أو الزجاج، وتوفير ركائز كافية لمرفق الخلية. ومع ذلك، فإن هذه المواد ليست قابلة للتعديل للفائدة أخرى في الجسم الحي. ويمكن تصور أنه يمكن تخصيصها من الحرير فيلم مادة بيولوجية في المختبر، ومتى تحققت التوقعات التجريبية يمكن للفيلم مخصص ترجمة مباشرة إلى نموذج في الجسم الحي. مثل تصميم تقرن بين في التجارب المختبرية والتجارب المجراة يوفر ميزة كبيرة لمثل هذه المواد الحيوية الحرير زرع أكثر من ركائز الأخرى التي تستخدم عادة في المختبر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> شرانق الحرير </td><td> تاجيما شوجي المحدودة. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS مونومر وعبر رابط، </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> كربونات الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> الليثيوم بروميد </td><td> سيغما </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> الشريحة-A-Lyzer </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 مل حقنة </td><td> بيكتون ديكنسون، </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> الفولاذ المقاوم للصدأ غسالة </td><td> متفوقة الغسالة </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24 لوحة جيد </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

الأفلام الحرير واعدة البروتين على أساس المواد الحيوية التي يمكن أن تكون ملفقة مع الدقة العالية واقتصاديا ضمن بيئة 1،2 البحوث المختبرية. هذه المواد تكون مرغوبة لانها تملك التحكم الى حد كبير خصائص الابعاد والمادية، وموافق للحياة وتعزيز التصاق الخلية، ويمكن تعديلها من خلال الزخرفة الطبوغرافية أو عن طريق تغيير كيميائيا على السطح، ويمكن أن تستخدم كمستودع للجزيئات البيولوجية النشطة للطلبات المتعلقة بالمخدرات 3-8. وبالإضافة إلى ذلك، والأفلام الحرير هي واضحة نسبيا لتصميم العرف، ويمكن أن تكون مصممة على حل في غضون دقائق أو تتحلل على مدى سنوات في المختبر أو في الجسم الحي، ويتم إنتاج مع فائدة إضافية تتمثل في أن يكون شفافا في الطبيعة، وبالتالي مناسبة للغاية لتطبيقات التصوير 9 - 13. منهجية نظام الثقافة المقدمة هنا يمثل نهجا قابلة للتقييم السريع للفيلم سطح الخلية والحريرالتفاعلات. أهمية خاصة هو استخدام الأفلام سطح الحرير المزخرف لدراسة الاختلافات في تكاثر الخلايا والاستجابات من الخلايا لمحاذاة 12،14. تم زرعها على ثقافات المصنف على كل صغيرة منقوشة ومسطح ركائز فيلم الحرير، ومن ثم تقييمها من خلال التصوير المرحلة على النقيض من الوقت الفاصل، المجهر الإلكتروني، وتقييم البيوكيميائية من النشاط الأيضي ومحتوى حمض النووي. وباختصار، فإن فيلم الحرير في منظومة ثقافة المختبر يوفر الإعداد للتخصيص التجريبية مناسبة لدراسة سطح الخلية التفاعلات على ركيزة مادة بيولوجية، والتي يمكن بعد ذلك أن يكون الأمثل ومن ثم ترجمتها إلى نماذج في الجسم الحي. ويجري حاليا استخدام نظام الملاحظات ثقافة المقدمة هنا تستخدم للمساعدة في تطبيقات تتراوح بين التفاعلات الخلية الأساسية لتصميم الجهاز الطبي، وبالتالي فهي ذات الصلة لمجموعة واسعة من المجالات الطبية.

Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

الأفلام الحرير هي فئة جديدة من المواد الحيوية للتخصيص بسهولة لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية. الفيلم الحرير قدم نظام ثقافة قابلة للتكيف للغاية لمجموعة متنوعة من<em&gt; في المختبر</em&gt; التحليلات. هذا النظام يشكل منصة تصميم مادة بيولوجية الطرح<em&gt; في المختبر</em&gt; التحسين قبل ترجمة مباشرة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نماذج.

نظام الحرير ثقافة السينما ل في المختبر تحليل وتصميم مادة بيولوجية

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

silk-film-culture-system-for-in-vitro-analysis-and-biomaterial-design

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

19.2K Views.  Weill Cornell Medical College. الأفلام الحرير هي فئة جديدة من المواد الحيوية للتخصيص بسهولة لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية. الفيلم الحرير قدم نظام ثقافة قابلة للتكيف للغاية لمجموعة متنوعة من في المختبر التحليلات. هذا النظام يشكل منصة تصميم مادة بيولوجية الطرح في المختبر

Video: Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

وهناك طريقة لتغليف المسام المبيض والثقافة في نظام 3 تحلل Proteolytically الأبعاد

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

التحليل المنهجي لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

تصميم بروتين الحرير الحرير المواد سبيكة للتطبيقات الطبية الحيوية

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system that can be easily implemented and adopted. The methodology is based on the configuration of specific types of sensors, machine-learning methods and procedures. The protocol is divided into four phases: (1) database creation (2) data analysis (3) system simplification and (4) evaluation. Using this methodology, we created a multimodal database for fall detection and human activity recognition, namely UP-Fall Detection. It comprises data samples from 17 subjects that perform 5 types of falls and 6 different simple activities, during 3 trials. All information was gathered using 5 wearable sensors (tri-axis accelerometer, gyroscope and light intensity), 1 electroencephalograph helmet, 6 infrared sensors as ambient sensors, and 2 cameras in lateral and front viewpoints. The proposed novel methodology adds some important stages to perform a deep analysis of the following design issues in order to simplify a fall detection system: a) select which sensors or combination of sensors are to be used in a simple fall detection system, b) determine the best placement of the sources of information, and c) select the most suitable machine learning classification method for fall and human activity detection and recognition. Even though some multimodal approaches reported in literature only focus on one or two of the above-mentioned issues, our methodology allows simultaneously solving these three design problems related to a human fall and activity detection and recognition system.

We present a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system. The goal is to build a system for accurate fall detection that can be easily implemented and adopted.

تصميم وتحليل لتبسيط نظام الكشف عن السقوط

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...