هذا البروتوكول يوفر استراتيجية سريعة وفعالة لاستخدام في وقت واحد اثنين من المقايسات لفحص عدة مئات من المركبات لآثارها على نمو الخلايا. يمكن أن تقدم لنا الأقوال معلومات حول ما إذا كانت مركبات محددة هي السامة للخلايا، وتمنع نمو الخلايا، أو تعزيز نمو الخلايا. من خلال الاستفادة من اثنين من المقايسات معا، ونحن قادرون على زيادة الدقة وتحديد المركبات السامة للخلايا.
في الحالات التي تختلف فيها نتائج اثنين من المقايسات، قد تسمح لنا هذه الاستراتيجية لتحديد مركب مع آثار فريدة على وظيفة الخلوية التي يمكن أن تدرس بشكل أكبر بوسائل أخرى. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية في أنها سريعة وغير مكلفة وغير كثيفة العمالة. مرة واحدة يتقن, فإنه يسمح للباحثين بسهولة أداء شاشة أولية تصل إلى 200 مركبات في أسبوع واحد, ومن ثم تنفيذ منحنى استجابة جرعة شاملة على 10 إلى 15 مركبات في أسبوع آخر.
وسوف يكون إثبات الإجراء هو أنا وروهيني مانيكام، وهو عالم في هيئة التدريس وزميل ما بعد البكالوريا من المختبر. أولاً، في خزانة السلامة البيولوجية، الخلايا الثقافية في قارورة T75 مع وسيط NSC بحيث تكون على الأقل 80٪ التقاء عند بدء الفحص. ووضع القارورة في حاضنة لثقافة الخلية التي تم تعيينها في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.
مرة واحدة الخلايا تصل إلى التقاء 80٪، وإزالة قارورة من الحاضنة وpirate قبالة وسيط NSC. إضافة ثلاثة ملليلتر من خلية انفصام الكاشف واحتضان لمدة خمس دقائق في الحاضنة. بعد الحضانة، إضافة سبعة ملليلتر من المتوسط NSC في القارورة، وماصة بقوة لضمان جميع الخلايا تصبح منفصلة.
نقل محلول الخلية المنفصلة إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسط NSC. استخدام عداد الخلايا الآلي أو قياس الهيموسيتات لحساب الخلايا، وإضافة وسيط NSC في أنبوب لإعادة ضبط تركيز الخلايا إلى 200،000 خلية لكل ملليلتر.
ثم، وذلك باستخدام ست فتحات من ثماني فتحات من ثمانية قناة pipettor متعدد القنوات لوحة 100 ميكرولترات من خلية خليط العمود عمود في 60 آبار الداخلية من ثلاثة 96 لوحات البئر التي تم المغلفة من قبل مصفوفة خارج الخلية. إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة قاعدة أو NSC المتوسطة لجميع الآبار دون خلايا لتقليل التبخر المحتمل من الآبار الخارجية التي تحتوي على الخلايا. تحت مجهر زراعة الخلية، فتش بصريا ما لا يقل عن 10 آبار على كل من لوحات الآبار الثلاثة 96 للتأكد من أن الخلايا جالسة في الكثافة المتوقعة.
احتضان في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة 16 إلى 24 ساعة بعد تقسيم، وpirate قبالة NSC عمود المتوسطة عمود مع ثمانية قناة متعدد الآبار الأنابيب، وذلك باستخدام ستة فقط من فتحات ثمانية متعددة الآبار. أضف 95 ميكرولترات من متوسط NSC الطازج إلى كل بئر من اللوحات الثلاثة ، ووضع اللوحات مرة أخرى في الحاضنة.
مع ثمانية قناة متعدد الآبار pipettor، إضافة 49 ميكرولترات من المتوسط NSC في كل من 60 آبار الداخلية من فارغة U القاع، V-القاع، أو مستديرة القاع 96 لوحة جيدا. فك الـ لوحة المركب الرئيسي المعدة. Pipette واحد ميكرولتر من المجمع من لوحة رئيسية في كل من 60 آبار الداخلية التي تحتوي على متوسط NSC، وخلط المجمع المخفف ثلاث مرات مع أنبوب أعلى مقاعد البدلاء.
بعد ذلك، إزالة ثلاث 96 لوحات بئر من NSCs من الحاضنة والاستغناء عن خمسة ميكرولترات من المجمع المخفف في كل بئر من اللوحات الثلاثة التي تحتوي على خلايا لتوليد تخفيف واحد إلى 1000 للتركيز المركب النهائي من 10 ميكرومولار مع تركيز DMSO خلايا Incubate 0.1٪ مع مركب لمدة 72 ساعة، والمضي قدما مع مقايسات السمية للخلايا. لأداء جرعة استجابة المقايسة، إعداد 96 جيدا. استخدام العمود الثاني لستة نظام مراقبة DMSO يكرر، واختبار ثلاث مرات من ما يصل إلى ثلاثة مركبات مختلفة في التخفيفات التسلسلية مزدوجة، في ست جرعات، بدءا من جرعة عالية من 10 ميكرومولار.
تخفيف أربعة ميكرولترات من 100٪ DMSO أو اختبار مركب في DMSO في 196 ميكرولترات من المتوسط NSC في أنبوب microcentuge 0.5 أو 1.5 ملليلتر. إضافة 25 ميكرولتر من DMSO المخفف للسيطرة على الآبار، و 50 ميكرولترات من مركبات الاختبار المخففة إلى آبارها المقابلة. Pipette 25 ميكرولترات من NSC المتوسطة إلى الآبار الفارغة المتبقية في الجزء الداخلي من لوحة 96 بئر.
مع أنبوب متعدد القنوات، نقل 25 ميكرولتر من المجمع من 10 آبار ميكرومولار إلى الآبار الدقيقة الخمس، واخلط خمس مرات على الأقل. استبدال نصائح ماصة، وتكرار العملية عن طريق خلط الصفوف المتبقية لتوليد ثلاثية في التخفيفات مضاعف لما مجموعه ست جرعات لكل من المركبات. نقل خمسة ميكروليتر من كل تخفيف في لوحة جديدة مع الخلايا الثقافة التي يجري اختبارها.
ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد أن يتم احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ووضعها داخل قارئ اللوحة. افتح برنامج المصوّر لإعداد البروتوكولات وتجربة الملفات للدراسة.
انتقل إلى وضع دليل الصور على إدارة المهام وانقر فوق التقاط الآن. اختيار 96 لوحة جيدا كنوع السفينة. حدد 10 مرات للتكبير، والبروتين الفلورسنت الأحمر 531 و 593 للتصوير tdTomato.
انقر على بئر. ثم انقر على التركيز البؤري التلقائي للتركيز على الصورة ، وفضح السيارات لوقت التعرض المناسب. ضبط التركيز والتعرض يدويًا عند الحاجة.
انقر على أيقونة الكاميرا لالتقاط الصورة. ثم انقر فوق تحليل المعالجة أعلاه الصورة لمتابعة إنشاء البروتوكول. وحدد علامة التبويب تحليل.
إلى يمين الصورة، انقر فوق تحليل خلوي في إضافة خطوة تحليل، وانقر فوق ابدأ. تُظهر الصورة خلايا مظلّزة للإشارة إلى كل خلية على حدة. انقر على اختيار خيارات لتغيير المعلمات لتحديد الخلايا بشكل أفضل استناداً إلى عتبة الفلوريسنس أو حجم الخلية.
إذا كان المصور يحسب الخلايا بشكل صحيح، فانقر على إضافة خطوة في أسفل الشاشة. انقر على الرمز الموجود أعلى الشاشة لإنشاء تجربة من مجموعة الصور. وعلى النافذة المفتوحة، انقر فوق الإجراء تحت علامة التبويب البروتوكول.
ثم، في النافذة الجديدة التي تفتح، حدد قراءة. انقر على Full Plate لتحديد الآبار الـ 60 التي تحتوي على الخلايا فقط. انقر فوق موافق لحفظ التغييرات.
ثم انقر فوق موافق في الإطار الإجراء. انقر فوق رمز التشغيل لتشغيل اللوحة. في المطالبة، حفظ الملف، ثم في موجه لوحة التحميل، انقر فوق موافق. عند الانتهاء من التصوير، قم بتنزيل بيانات عدد الخلايا من برنامج برنامج التصوير إلى جدول بيانات للتحليل.
في غضون ساعتين من الانتهاء من التصوير tdTomato، تبدأ MTT المقايسة. تزن بها 25 ملليغرام من MTT وإعادة تعليق ذلك في خمسة ملليلتر من المتوسط NSC لجعل خمسة ملليغرام لكل ملليلتر MTT حل الأسهم. دوامة الحل لعدة دقائق، حتى لا يكون هناك ترسبات مرئية من MTT.
إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة وpirate قبالة خلية ثقافة المتوسطة. تمييع MTT 1 إلى 10 في وسط NSC الطازجة ، وإضافة 100 ميكرولترات من MTT المخففة لكل بئر من الخلايا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
يُرى الترسبات الزخرافية تقريبًا بما يتناسب مع عدد الخلايا في البئر. التعرق حل MTT قبالة لوحات، وإضافة 50 ميكرولترات من 100٪ DMSO إلى كل بئر. ضع اللوحات على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 400 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، نقل لوحة إلى قارئ لوحة. اقرأ امتصاص كل بئر في الطول الموجي المحدد مسبقًا لـ 595 نانومتر، وتصدير البيانات إلى جدول البيانات للتحليل، تمامًا كما هو الحال بالنسبة لبيانات عدد الخلايا. وكشف فحص الصور الفلورية tdTomato اثنين من الآبار المتنافرة للسمية بين MTT و جرد الخلية.
بالنسبة لرُحَمٍ واحد، فإن بيانات عدد الخلايا لا تشير إلى سمية. لكن بيانات MTT فعلت. بئر آخر كان بالغ في تقدير عدد الخلايا من قبل MTT نسبة إلى العد tdTomato، ويبدو أن لديها خلايا أكبر، في حين أنه في الآبار حيث MTT التقليل من عدد الخلايا نسبة إلى tdTomato، ويبدو أن الخلايا أصغر.
وباختصار، صنّف فحص tdTomato 11 مركبًا على أنها سامة، و11 كمثبط للنمو، وواحد كتعزيز للنمو، مع عدم وجود تأثير واضح على نمو الخلايا 34. صنّف المقايسة MTT 13 مركبًا على أنها سامة، واثنان منها كمثبط للنمو، وواحد كتعزيز للنمو، مع عدم وجود تأثير واضح على نمو الخلايا 41. ويبين الرسم البياني للخلايا القابلة للحياة للمركب WP1066 منحنى مسطح نسبياً بدون سمية للتركيزات الأربعة الأدنى.
المنحنى يسقط بسرعة في جرعة المايكرومولار الخمسة، وينخفض إلى سمية كاملة تقريبا في 10 ميكرومولار، مما يؤدي إلى الجرعة القاتلة 50 كما 4.4 و 6.0 ميكرومولار لم مقايسة tdTomato ومجرسة MTT. ومن الأهمية بمكان أن يتم تخفيف المركبات بشكل صحيح في شاشة استجابة الجرعة بحيث يتم إنشاء منحنى استجابة الجرعة الصحيحة. يمكن للمركبات التي يحددها هذا الإجراء للتأثير على نمو الخلايا أن تتميز كذلك بالجراصير الوظيفية لتحديد مسارات الإشارات الجديدة المحتملة التي تتحكم في نمو الخلايا.
وقد تم اختبار المركبات السامة للخلايا الجذعية العصبية كعوامل علاجية محتملة لسرطانات الدماغ، مثل الورم الأرومي الدبقي والورم الأرومي العصبي. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند التعامل مع خلايا الثدييات، DMSO، وMTT. تخلص من DMSO و MTT وفقًا لإرشادات النفايات الكيميائية للمؤسسة الخاصة بك.
