The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

<ol>
	<li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy.">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li><li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cancer:+an+overview.">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li><li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design.">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499 (2013).</li><li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509.">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li><li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+(enzalutamide).">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li><li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition.">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li><li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance.">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li><li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes.">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li><li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding.">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li><li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition:+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer.">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li><li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein.">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li><li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes.">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li><li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines.">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71 (2013).</li><li>. GATK Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015)</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li><li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VarScan+2:+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing.">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li><li>. Oncotator Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015)</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).</li><li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms,+SnpEff:+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118;+iso-2;+iso-3.">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li><li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations:+application+to+cancer+genomics.">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li><li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIFT:+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function.">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li><li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2.">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exomes+of+the+NCI-60+panel:+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology.">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li><li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmic+2005.">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li><li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers.">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma.">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li><li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

وتدفع رسوم النشر لهذا المقال الذي H3 الطب الحيوي.

<html> اختيار خط الخلية (ق): توصيف الدولة الجينية وعدم الاستقرار الجيني مما لا شك فيه، فإن العامل الأكثر أهمية واحد في الكشف عن آليات المقاومة ذات الصلة سريريا بنجاح هو اختيار خط الخلية الأولية. وينبغي النظر عاملين. أولا، تهدف إلى تحديد خط الخلية (ق) من نفس النسب / سلالة إيواء الصفات الوراثية المميزة لهذا المرض (على سبيل المثال، BRAF V600E في سرطان الجلد). سوف استجواب البيانات transcriptomic وطفرة المتاحة علنا لكل من خطوط الخلايا 30-32 والأورام الأولية / ورم خبيث لمجموعة متنوعة من المؤشرات 33،34 تسهيل عملية الاختيار. على الرغم من تحديد خطوط الخلايا مع تغيرات جينية ذات الصلة سريريا مثالية، في بعض الحالات قد لا يكون هذا ممكنا بسبب عدم وجود خطوط الخلايا المتاحة أو ممكنا بسبب عوامل مثل صعوبة وطول عملية الفرز. &gt; وفيما يتعلق النقطة المذكورة أعلاه، والعامل الثاني للنظر ثم خلال اختيار خط الخلية هو سهولة أو جدوى المقاومة الفحص باستخدام الخط المطلوب. على سبيل المثال، يمكن لعوامل مثل انتشار ومعدلات الطفرة الجوهرية تؤثر بشكل كبير على سرعة الاكتشاف. تحقيقا لهذه الغاية، خطوط الخلايا يمكن استخدامها مع حركية النمو أسرع ونقص في الآليات DNA MMR على أمل أن ظهور المقاومة العفوية يمكن تسريع 35. استنادا إلى قاعدة بيانات الكونية وجود عدة خطوط الخلايا مرشح يعانون من نقص في واحد من اثنين تحور الجينات كثيرا MMR، MSH2 أو MLH1 (الجداول 2 و 3). بدلا من ذلك، إذا خطوط الخلايا من الفائدة لا وجود عيوب واضعة في MMR، العلاج حادة مع المطفرة الفيزيائية والكيميائية أو DNA التفاعلية مثل وكيل مؤلكل N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) يمكن استخدامها لتعزيز عدم الاستقرار الجيني. على الرغم من أن كلا النهجين قد ق كبيرHORTEN الوقت لتحقيق استنساخ المقاومة ومتابعة التسلسل، ينبغي إجراء اختبار وظيفي صرامة على الجينات المرشحة إلى عدد أكبر من غير وظيفية، من المرجح أن تظهر الطفرات الركاب. SNVs يمكن أن تكون رتبة أمر لتعظيم فرص لتحديد الطفرات ذات الصلة وظيفيا. أولا، واختيار تلك الطفرات التي المتكررة في استنساخ مستقلة سيزيد من احتمال هذه الطفرات هي دوافع المقاومة. في حال لم يتم تحديد الطفرات المتكررة، مع التركيز على SNVs التي تتلاءم مع آلية عمل الدواء (على سبيل المثال، الهدف المخدرات أو المستجيب المصب يعرف الهدف المخدرات) قد تكون ذات مغزى. في نهاية المطاف، ومعيار الذهب هو دائما تقييم تجريبي لنشاط المقاومة التي تمنح للSNVs مرشح خارج الرحم التعبير كدنا] في الخلايا الأبوية الحساس للأدوية. الحمض النووي RNA مقابل التسلسل تم إنشاء استنساخ مرة واحدة مقاومة، DNA و / أو RNAيمكن أن تكون متسلسلة حسب الحاجة. تسلسل الحمض النووي، إما exome أو كامل تسلسل الجينوم، سيسمح تحديد سلالة الجرثومية وجسدية المتغيرات، مثل تعدد الأشكال، indels ونسخ عدد المتغيرات. في حين أن أكثر ودية من حيث التكلفة exome التسلسل يركز على توليد يقرأ من مناطق الترميز المعروفة، وكامل الجينوم التسلسل توليد البيانات تسلسل للجينوم بأكمله التي قد تسهل التعرف على الطفرات في العناصر غير الترميز مثل القدرة أو miRNAs 36. ومع ذلك، لأنه لا يقاس بيانات التعبير الجيني خلال تسلسل الحمض النووي، فمن الصعب التنبؤ الذي تحور (ق) من المرجح أن يكون سائق وظيفية. في هذا الصدد، وتسلسل الحمض النووي الريبي، على الرغم من أن أكثر تكلفة، ويقدم هذه الميزة. حقيقة أن الدعوة طفرة يتم تنفيذ فقط على الأنواع RNA أعرب يعزز احتمال تحور الفائدة قد يكون سائق وظيفية. بالإضافة إلى السماح لمسح أكثر تركيزا من الطفرات لمتابعة التجارب الفنية وتسلسل الحمض النووي الريبي أيضاتقدم ميزة إضافية تتمثل في القدرة على تحديد التعديلات التعبير الجيني، الربط البديلة والأنواع RNA خيالية جديدة، بما في ذلك اندماج الجينات التي قد تخدم أيضا السائقين قوية اعتبارا من المقاومة. خط أنابيب المعلوماتية الحيوية يتم توفير أوامر سبيل المثال لأغراض التوضيح، ولكن لا وثائق أكثر تفصيلا والبرامج التعليمية المتاحة من معهد برود 16 وينبغي قراءتها جيدا قبل البدء في تحليل NGS. مصممة الأوامر التالية للبيئة قذيفة UNIX على نظام فيه جميع الأدوات والبيانات المرجعية تم مثبتة مسبقا. هذه الأوامر أيضا تحمل ملفات FASTQ تحتوي على تسلسل إقران نهاية يقرأ من عينتين، واسمه &quot;الدية&quot; و &quot;مقاومة&quot;، وردت من البائع وضعها في الدليل &quot;بيانات&quot;. في معظم الحالات يجب أن تتكيف هذه الأوامر أو الأمثل لتطبيق معين باستخدام إضافي وسيطة سطر الأوامرuments (على سبيل المثال، مضيفا &quot;-t 8&quot; إلى الأمر التحالف يتيح عملية مؤشرات في 8 النوى CPU). يجب أن تكون في كثير من الأحيان إضافة مجموعات القراءة (الذي تعيين التحالفات لعينات بيولوجية)، إلى ملفات BAM حتى إذا كان هناك نموذج واحد فقط لكل ملف بام، من أجل الامتثال لمتطلبات تنسيق ملف لأدوات معينة. قراءة المعلمات مجموعة RGID، RGSM، RGPL، RGPU، وRGLB يمكن أن تكون السلاسل التعسفية واصفا اسم العينة، منصة التسلسل، واستراتيجية المكتبة. في المختبر مباراة في الجسم الحي المقايسات على الرغم من أن عدة آليات المقاومة التي تم تحديدها عن طريق الانتقاء في المختبر وقد تم التحقق من أن تكون ذات صلة سريريا، هناك احتمال أن آليات قد لا تكون الآليات ذات الصلة أو الغالبة من المقاومة السريرية. وأحد أسباب ذلك يمكن أن تشمل دورا أساسيا للبيئة الصغرى في قيادة المقاومة للعلاج، وهو المكون الذي يخلو في بروتوكول تجريبي / إعداد دiscussed حتى الآن. في الواقع، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن العوامل المضادة للسرطان التي هي قادرة على قتل الخلايا السرطانية وتصبح غير فعالة عندما الخلايا السرطانية يتم تربيتها في وجود خلايا انسجة يعني الآليات الفطرية المقاومة التي يمنحها سدى 37،38. لتحديد هذه الآليات المقاومة المكتسبة التي يسببها سدى، يمكن للمرء أن ينظر في أداء في المختبر شارك في الثقافة أو في فحوصات مقاومة الورم الجسم الحي. منذ الفحص السابق معقد جدا، وكثير لجأت إلى توليد xenografts الورم المقاوم للأدوية لمعالجة الدور المحتمل للسدى في قيادة المقاومة. وقد كشفت هذه الدراسات سواء متطابقة 5 وفريدة من نوعها 39 آليات المقاومة بالنسبة للاختيار في المختبر، مما يعني أن سدى قد تلعب بالفعل دورا في هذا الأخير. ومع ذلك، لا بد من أن تضع في اعتبارها طول الوقت قد يستغرق لتوليد مثل هذه الأورام مقاومة وتعقيد متابعة الجيني تحليل complexitieالصورة بسبب عدم تجانس الجزيئية والخلوية داخل ورمي. تحديد الهدف بالإضافة إلى الكشف عن آليات المقاومة للأدوية، ويمكن أيضا أن تطبق هذا النهج التنميط الجيني استنادا NGS لتحديد أهداف الخلوية تحقيقات الكيميائية. تاريخيا، وقد استخدمت أساليب مشاركات متعددة لتحديد الآليات الخلوية من العمل والأهداف للمواد الكيميائية منخفضة الوزن الجزيئي مع الأنشطة البيولوجية، بما في ذلك تنقية تقارب إلى جانب البروتينات الكمية والأساليب الجينوم الخميرة، رني الفرز، والاستدلال الحسابي النهج 40. امتدادا لتوضيح آليات المقاومة للأدوية باستخدام استنادا NGS-التنميط الجيني أو transcriptomic من السكان الخلية مقاومة ظاهريا، وتحديد الاختلافات فريدة المتكررة النووية المنفردة (SNVs) أو التعديلات التعبير التي تمكن المقاومة يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة أهداف الخلوية الوظيفية للمركبات. تويستند على مفهوم أن مجموعة فرعية من آليات المقاومة لوحظ قد تنطوي على الطفرات المتكررة في الجينات التي تشفر بروتين الأهداف المباشرة للجزيء صغير. في الآونة الأخيرة، التحقق من صحة عدة تقارير الأداة المساعدة لهذا النهج، ولا سيما من خلال الجمع بين مع المناهج الأخرى بما في ذلك على نطاق واسع خط الخلايا السرطانية حساسية التنميط، لكشف أهداف الخلوية الصغيرة جزيء تحقيقات 9،10.

وقد أدى التوصيف الجزيئي مفصل من الجينوم الورم عن طريق تقنيات التسلسل قوية والأدوات التحليلية تحسن البيانات إلى اكتشاف تغيرات جينية رئيسية في أنواع معينة من السرطان 1،2. تطوير العلاجات المستهدفة التي تستهدف هذه الآفات الوراثية، مثل HER2، BCR-ABL، EGFR وALK، قد تحسنت بشكل ملحوظ نوعية الحياة للمرضى 1،2. ومع ذلك، على الرغم من خصوصية هذا النهج، كانت الاستجابة السريرية لمعظم العلاجات واحدة دون المستوى الأمثل كمقاومة يخرج في نهاية المطاف. مؤخرا، تم إحراز تقدم كبير في فهم الأسس الجزيئية لمقاومة العلاجات المستهدفة. يثير الاهتمام والفضول، فقد أصبح واضحا أن آلية بارزة للمقاومة تتضمن استمرار النشاط المستهدف / المسار. كما مثال على ذلك، مستقبلات الاندروجين (AR) -directed العلاج enzalutamide من سرطان البروستاتا يؤدي إلى إثراء تفعيل الطفرات في AR نفسها، والحفاظ على OUTP-AR يشيرحزب التحرير في وجود المانع 3-5. وقد أدى هذه المعرفة لحملة شرسة ل1) تطوير مضادات الجيل الثالث التي يمكن أن تستمر لقمع كل من WT وظيفة متحولة-AR في محكمة التحكيم الدائمة 3 و 2) تحديد العقد المصب المحتملة للAR الإشارات التي قد تكون مستهدفة للتدخل العلاجي مقاومة للenzalutamide . وبالمثل، ومقاومة للفئات الأخرى من مثبطات مثل تلك التي تستهدف EGFR، BRAF وABL غالبا ما تؤدي إلى حدوث طفرات أن تنشيط الأصلي الإدمان كيناز مسار 1. مع العلم بأن المقاومة يخرج حتما في معظم المرضى، ووضع نهج لتحقيق على وجه السرعة هذه الآليات للضوء تتيح تطوير علاجات فعالة للمتابعة. نهج واحد والذي يتم استخدامه على نطاق واسع هو تحليل الجينوم الأورام السريرية الحرارية بالنسبة للأورام معالجة ساذجة أو -sensitive لتحديد التخصيب / استنفاد في الآفات الوراثية التي قد تكون قابلة للدسجادة الاكتشاف. على الرغم من وعدها، وهناك نوعان من الالتزامات الرئيسية لهذا النهج الذي يعيق اكتشاف سريع. أولا، الوصول في الوقت المناسب لمواد ورم لاستجوابه الجيني قد يكون بمثابة عقبة كبيرة في الانتقال من العلاج إلى علاج. ثانيا، deconvolution من عدد لا يحصى من الآفات الوراثية في الإعداد مقاومة قد تكون صعبة منذ الأورام يمكن أن تقدم كبير البينية ورمي التجانس 6،7. في ضوء هذه التحديات، كانت هناك زيادة في الاعتماد على اكتشاف ما قبل السريرية آليات المقاومة. هذا النهج قد تسمح تحديد آليات مقاومة بارزة قبل التجارب السريرية 1 التي يمكن أن توجه استراتيجيات بديلة لإدارة السريرية في المرضى الذين لا يتحملون هذه الآليات إما قبل العلاج أو بعد ظهور المقاومة. واحدة من هذه الأداة اكتشاف ما قبل السريرية والذي يتم استخدامه على نطاق واسع هو تطبيق مشاركات شاشات رني الوظيفية. للامتحانسبيل، ويتاكر وزملاؤه تطبيق شاشة رني الجينوم على نطاق تحديد تلك الخسارة NF1 تتوسط مقاومة لسلاح الجو الملكي البريطاني ومنظمة مجاهدي خلق مثبطات خلال MAPK حقت تفعيل المسار 8. تم العثور على هذه النتائج لتكون وثيقة الصلة سريريا كما لوحظت الخسارة من وظيفة الطفرات في NF1 في BRAF الخلايا السرطانية -mutant التي هي في جوهرها مقاومة للRAF تثبيط الأورام وسرطان الجلد مقاومة للvemurafenib تفعيل 8. ومع ذلك، على الرغم من نجاح هذا النهج، وغالبا ما يتم تحديد العديد من الأهداف ذات الصلة سريريا، ويفترض بسبب التحيز الخسارة من وظيفة هذا النهج. في المقابل، أداة أقل انحيازا لاكتشاف ما قبل السريرية آليات المقاومة ينطوي على جيل من خطوط الخلايا المقاومة من خلال التعرض لفترات طويلة لمجمع الفائدة إلى جانب مقرها NGS-التنميط الجيني أو transcriptomic. وقد تم تنفيذ هذا النهج بنجاح من قبل عدة مجموعات لتحديد عفويةواحدة المتغيرات النوكليوتيدات أو التعبير التعديلات المتكررة التي تمكن المقاومة 5،9،10. على سبيل المثال، تم اكتشاف طفرة F876L المتكررة في AR مؤخرا في استنساخ مقاومة في المختبر 3-5 والأورام طعم أجنبي في الجسم الحي 5 قبل تحديد هذه الطفرة في العيادة 4. مؤخرا جدا، بانغ وزملاؤه (2015) 11 يستخدم ClonTracer في اثنين من النماذج ذات الصلة سريريا تبين أن الغالبية العظمى من الحيوانات المستنسخة المقاومة التي تنشأ أثناء التعرض للمخدرات لفترة طويلة كانت جزءا من قبل القائمة حيوانية مما يشير إلى أن الطفرات الأكثر أهمية وظيفيا ومن المرجح بالفعل موجودة مسبقا أن تصبح اختيارها لاختيار 11 خلال. وعلى النقيض من التنميط الجيني للأورام نوقش في وقت سابق، وهذا النهج فوائد من أقل التجانس كما تستخدم &quot;متجانسة&quot; استنساخ مقاومة للتحليل تسهيل تشريح الجيني أكثر دقة من السائقين المحتملة. Furthermخام، المثير، بالإضافة إلى إمكانية الكشف عن آليات المقاومة، وهذه الطريقة يمكن أن تطبق أيضا على تحديد الآليات الخلوية من العمل والأهداف من الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تكون هذه المعلومات غير معروف (10). نظرا للمزايا واضحة والاستخدامات المتعددة لهذا النهج، وهنا نقدم بروتوكول تفاصيل التنفيذ الناجح لمثل هذه الشاشة قبل السريرية لتعظيم إمكانات الاكتشافات ذات مغزى سريريا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

لتعظيم إمكانيات لاكتشاف السائقين وظيفية رئيسية من المقاومة، حدد استنساخ خلية واحدة للتوسع والاختبار المظهرية والتسلسل. كما هو موضح في الشكل 4A، خلايا HCT116 علاجها لفترة طويلة مع مجمع السامة للخلايا # 1 أدى إلى ظهور عفوية من الحيوانات المستنسخة المقاومة التي استمرت في النمو خلال فترة العلاج (الدوائر السوداء متقطع). كان قد تم اعتقالهم هذه الحيوانات المستنسخة باستخدام نهج # 1 أبرزت في الشكل (3) وتوسعت بعد ذلك لتحليل المظهري. كما هو مبين في الشكل 4B، استنساخ مقاومة 1-3 أبدت جميع مقاومة كبيرة لمجمع # 1 والوثيق مجمع التناظرية # 2 (أكبر الجدوى / النمو)، في حين أظهرت جميع الحيوانات المستنسخة حساسية للا علاقة لها velcade مجمع السامة للخلايا. بعد تأكيد المقاومة المظهري، وgDNA معزولة وقدمت لتحليل تسلسل كامل exome. تم تطبيق أدوات المعلوماتية الحيوية لتضييق في تلك المتغيرات على هيكليةهي 1) المتكررة و2) لديها القدرة للتأثير وظيفي (الشكل 5A). وأكد المتغيرات الهيكلية التي اجتمعت هذين المعيارين بواسطة أداة التسلسل مستقلة. كما هو موضح في الشكل 5B، طفرة مغلطة متخالف التي تم تحديدها باستخدام وقد أكد كامل exome تسلسل باستخدام طريقة التسلسل سانجر (لوحة العلوي، وتسلسل WT؛ اللوحة السفلى، وتسلسل متحولة). عقب تأكيد تسلسل، وكان خط الخلية الوالدية في الأصل تستخدم لفحص مقاومة وراثيا للتعبير عن كدنا] متحولة إلى تأكيد وظيفيا دور الطفرة. كما هو موضح في الشكل (6)، في حين overexpression من وWT كدنا] فشل في منح المقاومة، واضطر تعبير عن كدنا] متحولة الممنوحة بشكل ملحوظ مقاومة المظهرية لمجمع رقم 1، مما يؤكد الدور الوظيفي لهذا الاختلاف الهيكلي كمحرك للمقاومة. وترد جميع الكواشف المستخدمة في هذه التجربة في الجدول 1 </s<html> ترونج&gt;. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيط فحص ومراقبة لوحات. الظل الأزرق والآبار العلاج المركب. الظل الأبيض والمتوسط ​​فقط. مركبات مخففة متسلسل 1: 4 وتدار في يثلث (BD أو EG). 2 مركبات يمكن تطبيقها في لوحة. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> الشكل 2. منحنيات الجدوى التمثيلية. يمثل الخط الأحمر المنقط اليوم 0 القراءة. المحور السيني يشير إلى زيادة جرعة من مركب إلى اليمين والمحور الصادي يمثل بقاء نسبة إلى آبار المراقبة DMSO. GI 100 = الجرعات المستخدمة لتحقيق 100٪ إعاقة النمو. GI 50 = الجرعة المستخدمة للحد من قابلية إلى 50٪ من السيطرة DMSO. <html> _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. نهجين لاختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للتوسع. نهج 1- استخدام pipettor لالتقاط ونقل الحيوانات المستنسخة واضحة المعالم لوحات 48-جيدا. غارقة التربسين- نهج 2- استخدام أقراص الاستنساخ لرفع استنساخ ونقل إلى لوحات 48-جيدا. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> الرقم 4. التأكيد المقاومة التي تحققت لاستنساخ HCT116 إلى تفاقم # 1 في المختبر. (A) مجمع # ظهرت استنساخ HCT116 المقاوم لل1 التالية مستمرة اختيار ثلاثة أسابيع. تم اختبار (B) قابلية السيطرة ومقاومة الحيوانات المستنسخة بعد العلاج 72 ساعة مع مركبات مختلفة. مجمع رقم 2 هو التناظرية وثيقة من مجمع # 1. وقد استخدم Velcade كعامل السيطرة السامة للخلايا. وتظهر البيانات كمتوسط ​​+ الانحراف المعياري من ثلاثة مكررات البيولوجية. EP-together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig5.jpg" /> الرقم 5. تحديد فريدة من نوعها، وتحور المتكررة (المتغيرات النووية المنفردة، SNVs) في الجين A في مجمع # استنساخ HCT116 المقاوم لل1. التدفق (A) العمل على تحديد SNVs موجودة في جميع الحيوانات المستنسخة المقاومة وتوقع أن يكون لها تأثير وظيفي عال بواسطة MutationAssessor. (B) تأكيد من طفرة في الجين A من قبل سانجر تسلسل. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> الرقم 6. إعادة التعبير عن تحور الجين A المقاومة الممنوحة للتفاقم # 1 في المختبر. تم اختبار الجدوى من خطوط الخلايا HCT116 المهندسة بعد العلاج 72 ساعة مع مجمع # 1. خطوط الخلايا الطافرة-HCT116 WT أو يعبرون عن ثابت WT أو cDNAs متحولة من جين A، على التوالي. وتظهر البيانات كما هو متوسط ​​+ الانحراف المعياري سو ثلاثة مكررات البيولوجية. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم عينة </td><td> الأحماض الأمينية </td><td colspan="2"> الأنسجة الابتدائية </td><td> Zygosity </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> عنق الرحم </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> عنق الرحم </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> بشرة </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> مبيض </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> مبيض </td><td> متخالف </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> ثدي </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> البروستات </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> لوفو </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> SKUT-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> بطانة الرحم </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> SKUT-1B </td><td> رر787fs * 11 </td><td colspan="2"> بطانة الرحم </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr></tbody></table> الجدول 1. MSH2 خطوط الخلايا -mutated. خط الخلية (اسم العينة)، استبدال الأحماض الأمينية، وأشارت النسب المنشأ وzygosity. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم عينة </td><td> الأحماض الأمينية </td><td colspan="2"> الأنسجة الابتدائية </td><td> Zygosity </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> ص؟ </td&gt; <td colspan="2"> البروستات </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> مبيض </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> معدة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> PR-ميل </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> بشرة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> REH </td><td> ص؟ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> متماثل </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0؟ </td><td colspan="2"> مبيض </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> الأمعاء الغليظة </td><td> متماثل </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> بنكرياس </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> بنكرياس </td><td> متخالف </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> بنكرياس </td><td> متخالف </td></tr></tbody></table> الجدول 2. MLH1 خطوط الخلايا -mutated. خط الخلية (اسم العينة)، استبدال الأحماض الأمينية، وأشارت النسب المنشأ وzygosity.

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

مقاومة الجراثيم للأدوية إلى العلاجات المستهدفة على نطاق واسع، وضرورة تحديد آليات المقاومة - قبل أو بعد الإصابة السريرية - أمر بالغ الأهمية لتوجيه استراتيجيات إدارة السريرية بديلة. هنا، نقدم بروتوكول لزوجين اشتقاق خطوط المقاوم للأدوية في المختبر مع التسلسل لتسريع اكتشاف هذه الآليات.

تنفيذ<em&gt; في المختبر</em&gt; المخدرات المقاومة فحوصات: تعظيم إمكانات لكشف آليات المقاومة ذات الصلة سريريا

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.5K Views.  H3 Biomedicine.  مقاومة الجراثيم للأدوية إلى العلاجات المستهدفة على نطاق واسع، وضرورة تحديد آليات المقاومة - قبل أو بعد الإصابة السريرية - أمر بالغ الأهمية لتوجيه استراتيجيات إدارة السريرية بديلة. هنا، نقدم بروتوكول لزوجين اشتقاق خطوط المقاوم للأدوي...

Video: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

تقييم استجابة عضلي وVasoactivity في الشرايين المقاومة مساريقي عن طريق تخطيط العضل الضغط

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

تحسين ثقافة خلايا الورم الدبقي عالية الجودة من العينات الجراحية لاستخدامها في النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريا والكيمياء المناعية ثلاثية الأبعاد

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

على طريقة الرصد بأسعار معقولة HIV-1 المقاومة للمخدرات المناطق ذات الموارد المحدودة

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

بطء الإفراج تسليم المخدرات من خلال Elvax 40W إلى الجرذ الشبكية: الآثار المترتبة على علاج الحالات المزمنة

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

رواية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنيات نقل الجينات و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات وبناء خلية لدراسة فقدان العظام في اضطرابات العضلات والعظام

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

تقييم فعالية سرطان المخدرات توعية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can improve strength in individuals with MS, however; it remains unclear the duration of RST that is needed to make strength gains and how to adapt hip strengthening exercises for individuals of varying strength using only resistance bands. This paper describes the methodology to set up and implement an adapted resistance strength training program, using resistance bands, for individuals with MS. Directions for pre- and post-strength tests to evaluate efficacy of the strength-training program are included. Safety features and detailed instructions outline the weekly program content and progression. Current evidence is presented showing that significant strength gains can be made within 8 weeks of starting a RST program. Evidence is also presented showing that resistance strength training can be successfully adapted for individuals with MS of varying strength with little equipment.

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis. Isolated muscle strengthening is a useful method to target specific weaknesses. This protocol describes a progressive resistance-training program using exercise bands to increase hip muscle strength.

التدريب تكييفها المقاومة يحسن قوة في ثمانية أسابيع في الأفراد الذين يعانون من مرض التصلب العصبي المتعدد

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

نموذج لمحاكاة نقص الأكسجة ذات الصلة سريريا في البشر

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

نموذج خلية ثقافة مقاومة الشرايين

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

تقييم آليات مراقبة الأوعية الدموية استخدام الفحص المجهري الفيديو الشرايين المقاومة المعزولة من الفئران

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...