يسمح لنا أسلوبنا بتصور جزيئات مفردة مع مساحة صورة أكبر بـ 40 مرة من الطرق التقليدية، كما أنها تحتوي على إشارة خلفية أقل بكثير. على عكس التقنيات الأخرى نهجنا يستخدم عدسة هدف واحد، لا يتطلب غرفة عينة خاصة، وأنه متوافق بسهولة مع أنظمة المجهر التجاري. بعد جمع المكونات اللازمة بدء بناء النظام.
هنا، هناك العديد من العناصر الموجودة بالفعل في منصب على مقاعد البدلاء. شنت على كتلة الألومنيوم هو الجسم المجهر مع مرحلة بيزو وحامل العينة. أيضا على مقاعد البدلاء هي ثلاثة أشعة الليزر والعناصر البصرية للجمع بين الحزم.
وتقترن الحزم مجتمعة إلى الألياف وضع واحد بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. كخطوة أولية نهائية، قم بتجميع مصدر ضوء مُتكنّم في نظام قفص. هذا لديه مصدر ضوء متماسك مؤقت متصل بألياف وضع واحد، محول ألياف، عدسة مُكرومة والقزحية.
ابدأ العمل مع مسار الكشف. أولا ، ضع مصدر الضوء التكاء في منفذ الجسم المجهر الهدف. ضبط المرآة تحت الأهداف حتى شعاع الإخراج أفقي تقريبا ومحاذية مع ثقوب مقاعد البدلاء.
إدراج مرآة dichroic في مسار شعاع وتعكس شعاع بنسبة 90 درجة. إضافة المرايا للسماح بتعديل مسار الحزمة المنقولة إلى كاميرا sCMOS. استخدام المرايا لضمان شعاع يضرب مركز الرقاقة.
بعد ذلك، أدخل عدسة أنبوب طول بؤري 300 ملليلتر حول طول بؤري من الكاميرا. إزالة مصدر الضوء التكاء من الجسم المجهر. ثم ضبط موقف عدسة أنبوب من أجل تعيين الطائرة التنسيق.
إيقاف التعديلات عندما تقوم الكاميرا بحل النمط على السقف بشكل واضح. يتم تصوير مسار الكشف في هذا التخطيطي. لاحظ إضافة مرشح تمرير متعدد النطاقات قبل عدسة الأنبوبة للتصوير الفلوري متعدد الألوان.
العودة إلى الجسم المجهر. هناك، أعد تثبيت مصدر الضوء التكاء في حامل الهدف. بعد المرآة dichroic، وضع مرآة أضعاف في مسار شعاع منعكس لإعادة توجيهه بمقدار 90 درجة.
إزالة مصدر الضوء التكاء من الجسم المجهر ووضعها في مكان قريب. بعد ذلك ، أدخل عدسة طول بؤري 400 ملليمتر في طول بؤري من المرآة. في الجسم المجهر تثبيت عدسة الهدف.
ثم ضبط موقف المرآة على طول المحور البصري. مراقبة السقف فوق الهدف ووقف عندما يتم تشكيل نمط القرص الهواء الكمال هناك. الآن إزالة الهدف وإعادة تثبيت مصدر ضوء collimated مع القزحية مفتوحة.
تحديد أين على طول مسار شعاع شعاع هو أصغر في حوالي 400 ملليمتر بعيدا عن المرآة. بمجرد تحديد النقطة ، جبل مرآة هناك ، على متن طائرة صورة مترافق. تظهر حالة الإعداد في هذه المرحلة في هذا التخطيطي.
النسخة المتطابقة المضافة للتو تسمى M5. إدراج مرآة أخرى لتعكس شعاع 90 درجة، وجبل عدسة طول بؤري 150 ملليمتر وراء ذلك. يجب أن تكون العدسة 150 ملليمتر من الطائرة صورة مترافق. بعد ذلك ، تأخذ مؤقتا العدسة الأولى في مسار شعاع الإثارة.
مع هذا التكوين العثور على موقف بؤري من العدسة الثانية. وضع مرآة galvo محور واحد في هذه النقطة المحورية باعتبارها مترافق مرة أخرى على مستوى التنسيق. توريد فولت صفر إلى مرآة galvo وتدوير حامله بحيث يعكس شعاع 90 درجة.
المقبل على طول مسار شعاع، ووضع مرآة أضعاف التي تعكس شعاع في 90 درجة. ضع العدسة 100 ملليمتر على طول مسار الحزمة من الطائرة المحورية المترافقة. مرة أخرى، إزالة مصدر الضوء collimated من جبل المجهر.
أضف عدسة 100 ملليمتر أخرى مع محول ألياف ألياف أحادية الوضع مع القزحية. ثم استخدم القزحية والألياف والعدسة لإرسال شعاع متكن عبر نظام التصوير. بعد ذلك، أدخل عدسة أسطوانية من طول بؤري 400 ملليمتر قبل عدسة التكميل الأخيرة في مسار الحزمة.
استخدمها لتركيز الشعاع. إدراج عدسة أسطوانية 50 ملليمترا 450 ملليمتر أمام الأول. هذا هو تمثيل تخطيطي للإعداد النهائي مع كل من اكتشاف وإثارة المسارات.
يقترن الإخراج من الليزر ثلاثة في المسار من قبل الألياف وضع واحد. للاختبار إعداد عينة هيدروجيل 3D. هذا واحد يتكون من 20 نانومتر قرمزي الخرز مختلطة مع الهيدروجيل.
في مكان الإعداد عينة هيدروجيل في حامل العينة. لإثارة عينة بدوره على الليزر 638 نانومتر وضبط قوتها إلى أقل من ميليواط واحد. قم بإعداد برنامج التحكم في الكاميرا في وضع المشغل الداخلي والتقاط الفيديو.
عند هذه النقطة محرك galvo لديه فولت صفر تطبيقها. ضع الكاميرا بحيث تكون الصورة في مركز العدسة. بعد ذلك، قم بضبط المرآة التي هي مستوى الصورة المترافقة.
تدوير مقبض أفقي على المرآة من أجل تحقيق إضاءة ذات ميل كبير. تسجيل صورة البلاط كما هو الحال في صورة الفلوريسنس عينة من هيدروجيل 3D مع الخرز 20 نانومتر. شريط مقياس هو 20 ميكرومتر.
المضي قدما بعد إعداد الأجهزة والبرامج لاكتساح مرآة galvo. هذا هو برنامج اكتساح مرآة غالفو للإعداد. ترتيب لـ مجال كامل من عرض التصوير عن طريق تعيين Vmin إلى ناقص 500 ميليفولت.
ثم تعيين Vmax إلى 500 ميليفولت. بعد ذلك، انتقل إلى برنامج اقتناء الكاميرا. في وضع المشغل حدد خارجي.
ضمن القائمة المنسدلة LightScan PLUS حدد أسفل التالي، انقر فوق التحكم في سرعة المسح الضوئي. يمكن تعيين معلمات تحكم معينة الآن. ضمن "ارتفاع النافذة" أدخل 180 صفاً.
تحت التعرض أدخل 28 مللي ثانية. عند الانتهاء، ارجع إلى برنامج التحكم في المرآة. في مرآة التحكم في برنامج التبديل على 3D المكدسات ON. تحديد عدد المكدسات وحجم الخطوة.
انقر على التقاط الفيديو لبدء تسجيل الصور. هذا مثال على التصوير Epi للحمض النووي المسمى واحد. على النقيض من ذلك ، فإن تقنية البلاط شديدة الميل التي اجتاحت أنتجت هذه الصورة.
تعرض صورة HIST خلفية أقل مقارنة بالصورة Epi. الحمض النووي في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد، والطول الموجي الإثارة هو 638 نانومتر. هنا هو صورة Epi من المسمى eukaryotic عامل التهجين الترجمة 2.
وقد تحسنت صورة HIST نسبة الإشارة إلى الخلفية. كما أن لديها إضاءة أكثر اتساقا. كلاهما لديه نفس قوة الإضاءة من 7.5 مللي واط.
كانت سرعات التصوير 2.5 إطار في الثانية. من المهم الحفاظ باستمرار على زاوية عالية الميل ، ومزامنة المرآة الكاسحة مع قراءة الكاميرا. وهذا يضمن نسبة إشارة عالية إلى خلفية أثناء الحصول على الصور.
نتوقع أن المجهر HIST سوف تستفيد العديد من التطبيقات بما في ذلك التصوير فائقة الدقة في أعماق التصوير أعمق وعالية الإنتاجية الجينات التعبير التنميط في شرائح الأنسجة سميكة.
