Metodumuz, geleneksel yöntemlere göre 40 kat daha büyük görüntü alanına sahip tek molekülleri görselleştirmemizi sağlar ve büyük ölçüde azaltılmış bir arka plan sinyaline sahiptir. Diğer tekniklerden farklı olarak yaklaşımımız tek objektif bir lens kullanır, özel bir numune odası gerektirmez ve ticari mikroskop sistemleri ile kolayca uyumludur. Gerekli bileşenleri topladıktan sonra sistemi oluşturmaya başlar.
Burada, birkaç unsur zaten bankta pozisyonda bulunmaktadır. Alüminyum blok üzerine monte piezo sahne ve örnek tutucu ile bir mikroskop gövdesi. Ayrıca bankta üç lazerler ve optik elemanları kirişler birleştirmek için vardır.
Birleştirilmiş kirişler mümkün olduğunca verimli bir şekilde tek bir mod fiber ile birleştirilir. Son bir ön adım olarak, bir kafes sistemi içinde bir collimated ışık kaynağı monte. Bu tek bir mod fiber bağlı geçici bir tutarlı ışık kaynağı vardır, bir lif adaptörü, akromatik lens ve iris.
Algılama yolu ile çalışmaya başlayın. İlk olarak, mikroskop gövdesinin nesnel bağlantı noktasına harmanlanmış ışık kaynağını yerleştirin. Çıkış Demeti kabaca yatay ve tezgah delikleri ile hizalanmış böylece hedeflerin altında ayna ayarlayın.
Işın yoluna bir dikroik ayna yerleştirin ve ışını 90 derece yansıtın. İletilen ışının yolunun bir sCMOS kameraya ayarlanabilmesi için aynalar ekleyin. Kirişin çipin ortasına isabet etmesini sağlamak için aynaları kullanın.
Ardından, kameradan odak uzaklığı hakkında 300 mililitrelik odak uzaklığı tüpü ekleyin. Mikroskop gövdesinden collimated ışık kaynağı çıkarın. Daha sonra odak düzlemini ayarlamak için tüp merceğin konumunu ayarlayın.
Kamera tavandaki deseni net bir şekilde çözdüğünde ayarlamaları durdurun. Algılama yolu bu şematik te betimlenmiştir. Çok renkli floresan görüntüleme için tüp lensin önüne çok bantlı geçiş filtresi eklenmesine dikkat edin.
Mikroskop gövdesine geri dön. Orada, objektif tutucuda harmanlanmış ışık kaynağını yeniden yükleyin. Dikroik ayna sonra, 90 derece yönlendirmek için yansıyan Kiriş yoluna bir kat-ayna yerleştirin.
Harmanlanmış ışık kaynağını mikroskop gövdesinden çıkarın ve yakınına yerleştirin. Daha sonra, aynadan yaklaşık bir odak uzaklığı 400 milimetrelik odak uzaklığı lens takın. Mikroskop gövdesinde objektif lensi töbebleyin.
Daha sonra aynanın optik eksen boyunca konumunu ayarlayın. Hedefin üzerindeki tavanı gözlemleyin ve orada mükemmel bir Havadar disk deseni oluştuğunda durun. Şimdi hedefi kaldırın ve açık bir iris ile collimated ışık kaynağı yeniden yükleyin.
Işın yolu boyunca, aynadan yaklaşık 400 milimetre uzaklıkta ki ışının en küçük olduğu yeri belirleyin. Nokta tanımlandıktan sonra, oraya bir ayna, konjuge bir görüntü düzlemi monte edin. Bu noktada kurulan durumu bu şematik görünür.
Sadece eklenen ayna M5 etiketli. Işını 90 derece yansıtacak başka bir ayna yerleştirin ve 150 milimetrelik odak uzaklığı merceği yerleştirin. Lens, konjuge görüntü düzleminden 150 milimetre uzakta olmalıdır. Sonra, geçici olarak uyarma ışın yolu ilk lens götürmek.
Bu yapılandırma ile ikinci lensin odak konumunu bulun. Bu odak noktasına konjuge arka odak düzlemi olarak tek eksenli galvo aynası yerleştirin. Galvo aynasına sıfır volt tedarik edin ve tutucuyu ışını 90 derece yansıtacak şekilde döndürün.
Işın yolu boyunca sonraki, 90 derece de Kiriş yansıtan bir kat-ayna yerleştirin. Lensi konjuge arka odak düzleminden ışın yolu boyunca 100 milimetre yerleştirin. Bir kez daha, mikroskop yuvasından kolimlenmiş ışık kaynağını çıkarın.
Bir iris ile birlikte bir lif adaptörü ve tek modlu fiber ile başka bir 100 milimetrelik kolimasyon lens ekleyin. Sonra görüntüleme sistemi üzerinden bir collimated ışın göndermek için iris, fiber ve lens kullanın. Daha sonra, ışın yolundaki son harmanlama merceğinden hemen önce odak uzaklığı 400 milimetrelik silindirik bir lens yerleştirin.
Işına odaklanmak için kullan. 50 milimetrelik silindirik lensi ilkinin önüne 450 milimetre önleyin. Bu, hem algılama hem de uyarma yolları ile son kurulumun şematik bir gösterimidir.
Üç lazerin çıkışı tek modluk lif ile yola birleştiğinde. Test için bir 3D hidrojel numunesi hazırlayın. Bu hidrojel ile karışık 20 nanometre kıpkırmızı boncukoluşur.
Kurulum yerinde numune tutucuda hidrojel numunesi. Örnek uyarma için 638 nanometre lazer açın ve daha az bir miliwatt gücünü ayarlayın. Kamera kontrol yazılımını dahili tetik modunda ayarlayın ve video çekin.
Bu noktada galvo motorunda sıfır volt uygulanır. Kamerayı, görüntünün merceğin merkezinde olacak şekilde yerleştirin. Ardından, eşlekapgörüntü düzlemi olan aynayı ayarlayın.
Yüksek eğimli bir aydınlatma elde etmek için aynadaki yatay ahzıdöndürün. 20 nanometre boncuklu 3D hidrojel örnek floresan görüntüsünde olduğu gibi kiremit görüntüsünü kaydedin. Ölçek çubuğu 20 mikrometredir.
Galvo aynasüpürmek için donanım ve yazılım kurduktan sonra devam edin. Bu kurulum için galvo ayna süpürme yazılımıdır. Vmin'i eksi 500 milivolta ayarlayarak tam görüş alanı görüntülemesi ayarlayın.
O zaman Vmax'ı 500 milivolta ayarla. Ardından, kamera satın alma yazılımına geçin. Tetikleme Modunda Harici'yi seçin.
LightScan PLUS açılır menüsünün altında Aşağı İleri'yi seçin, Scan Hız Kontrolü'nü tıklatın. Artık belirli kontrol parametreleri ayarlanabilir. Pencere Yüksekliği altında 180 satır girin.
Pozlama altında 28 milisaniye girin. Bittiğinde, ayna kontrol yazılımına geri dönün. 3D yığınları üzerinde ayna kontrol yazılımı anahtarı on. Yığın sayısını ve adım boyutunu belirtin.
Görüntüleri kaydetmeye başlamak için video çek'i tıklatın. Bu, tek iplikçikli etiketli DNA'nın Epi görüntülemesinin bir örneğidir. Buna karşılık, yüksek eğimli süpürülen kiremit tekniği bu görüntüyü üretti.
HIST görüntüsü, Epi görüntüsüne göre daha az arka plan gösterir. DNA 3Boyutlu hidrojelde ve uyarma dalga boyu 638 nanometre. Burada etiketli ökaryotik çeviri uzama faktörü 2 bir Epi görüntüdür.
HIST görüntüsü, sinyal-arka plan oranını iyileştirmiştir. Ayrıca daha düzgün aydınlatma vardır. Her ikisi de 7,5 miliwatt'lık aynı aydınlatma gücüne sahiptir.
Görüntüleme hızları saniyede 2,5 kare idi. Sürekli olarak yüksek eğim açısını korumak ve süpürme aynasını kamera okumasıyla senkronize etmek önemlidir. Bu, görüntü edinimi sırasında yüksek sinyal-arka plan oranını garanti eder.
HIST mikroskobunun daha derin görüntüleme derinliklerinde süper çözünürlüklü görüntüleme ve kalın doku dilimlerinde yüksek iş yapma gen ekspresyonu gibi çeşitli uygulamalara fayda sağlamasını bekliyoruz.
