Наш метод позволяет визуализировать отдельные молекулы с 40-й площадью изображения в 40 раз больше, чем обычные методы, и имеет значительно уменьшенный фоновый сигнал. В отличие от других методов, наш подход использует один объективный объектив, не требует специальной камеры образца, и он легко совместим с коммерческими системами микроскопа. После сбора необходимых компонентов причинайте строить систему.
Здесь несколько элементов уже находятся в положении на скамейке запасных. На алюминиевом блоке установлен корпус микроскопа со сценой Пьезо и держателем образца. Также на скамейке находятся три лазера и оптические элементы для объединения лучей.
Комбинированные балки максимально эффективно соединены с одним режимом. В качестве последнего предварительного шага, собрать коллимированный источник света в клетке системы. Это имеет временный когерентный источник света, подключенный к единому режиму волокна, адаптер волокна, ахроматические линзы и радужной оболочки глаза.
Начните работу с пути обнаружения. Во-первых, поместите коллимированный источник света в объективный порт тела микроскопа. Отрегулируйте зеркало под целями, чтобы выходной луч был примерно горизонтальным и выравнивался с отверстиями скамейки.
Вставьте дихроическое зеркало в траекторию луча и отразьте луч на 90 градусов. Добавьте зеркала, чтобы обеспечить регулировку пути передаваемого луча на камеру sCMOS. Используйте зеркала, чтобы убедиться, что луч попадает в центр чипа.
Затем вставьте 300-миллилитровый фокусный объектив трубки о фокусном длине от камеры. Удалите коллимированный источник света из тела микроскопа. Затем отрегулируйте положение трубки объектив для того, чтобы установить его фокусной плоскости.
Остановите регулировки, когда камера четко разрешает рисунок на потолке. Путь обнаружения изображен в этой схеме. Обратите внимание на добавление многодиам полоса пройти фильтр перед трубчатой линзы для многоцветной флуоресценции изображения.
Вернитесь к микроскопу тела. Там переустановить коллимированный источник света в объективном держателе. После дихроического зеркала поместите складное зеркало на путь отраженного луча, чтобы перенаправить его на 90 градусов.
Удалите коллимированный источник света из тела микроскопа и поместите его поблизости. Затем вставьте 400-миллиметровый фокусный объектив длиной около фокусного от зеркала. На корпус микроскопа устанавливают объектив цели.
Затем отрегулируйте положение зеркала вдоль оптической оси. Наблюдайте за потолком над целью и остановитесь, когда там образуется идеальный шаблон Airy disk. Теперь удалите цель и переустановить коллимированный источник света с открытой радужной оболочкой.
Определите, где вдоль пути луча луч является самым маленьким на уровне около 400 миллиметров от зеркала. После того, как точка определена, смонтировать зеркало там, спряженный плоскости изображения. Состояние настройки на данном этапе отображается в этой схеме.
Зеркало только что добавил помечены M5. Вставьте другое зеркало, чтобы отразить луч на 90 градусов и смонтировать 150-миллиметровую фокусную линзу за его пределами. Объектив должен быть на 150 миллиметров от конъюгированных плоскостей изображения. Далее временно завехаем первый объектив в траектории возбуждения луча.
С помощью этой конфигурации найти координационное положение второго объектива. Поместите одно зеркало оси galvo в этом координационном центре в качестве спряженной задней фокусной плоскости. Поставь ноль вольт к зеркалу galvo и поверните его держатель так, чтобы он отражали луч на 90 градусов.
Далее вдоль пути луча, поместите складное зеркало, которое отражает луч на 90 градусов. Поместите объектив 100 миллиметров вдоль пути луча от спряженной задней фокусной плоскости. Еще раз удалите коллимированный источник света с крепления микроскопа.
Добавьте еще 100-миллиметровую коллимацию с адаптером волокна и волокном в одном режиме вместе с радужной оболочкой глаза. Затем используйте радужную оболочку, волокно и объектив для отправки коллимированного луча через систему визуализации. Затем вставьте цилиндрическую линзу фокусного длины 400 миллиметров перед последней коллимацией объектива в траектории луча.
Используйте его, чтобы сфокусировать луч. Вставьте 50-миллиметровый цилиндрический объектив 450 миллиметров перед первым. Это схематическое представление окончательной установки как с путями обнаружения, так и с траекторией возбуждения.
Выход из трех лазеров соединен в путь одним волокном режима. Для тестирования подготовьем 3D-образец гидрогеля. Этот состоит из 20-нанометровых малиновых бусин, смешанных с гидрогелем.
При установке поместите образец гидрогеля в держатель образца. Для образца возбуждение включите 638-нанометровый лазер и отрегулируйте его мощность до менее чем одного милливатта. Настройка программного обеспечения управления камерой во внутреннем режиме триггера и захват видео.
На данный момент гальво двигатель имеет нулевой вольт применяется. Распоить камеру так, чтобы изображение было в центре объектива. Затем отрегулируйте зеркало, которое является плоскостью спряжения изображения.
Поверните горизонтальную ручку на зеркало, чтобы добиться высоко наклонного освещения. Завехать изображение плитки, как в образце флуоресценции изображения 3D гидрогеля с 20-нанометровой бусиной. Шкала бара составляет 20 микрометров.
Продолжить после настройки аппаратного и программного обеспечения, чтобы подмести зеркало galvo. Это galvo зеркало развертки программного обеспечения для установки. Организуйте полное изображение поля зрения, установив Vmin до минус 500 милливольт.
Затем установите Vmax до 500 милливольт. Затем переключитесь на программное обеспечение для приобретения камеры. В режиме триггера выберите Внешний.
В меню LightScan PLUS выберите Down Next, нажмите Scan Speed Control. Теперь можно установить определенные параметры управления. Под окном Высота введите 180 строк.
Под экспозицией введите 28 миллисекунд. После этого вернитесь к программному обеспечению для управления зеркалом. В зеркальном управлении программное обеспечение включает 3D стеки ON. Укажите количество стеков и размер шага.
Нажмите взять видео, чтобы начать запись изображений. Это пример Эпи изображения одной нити помечены ДНК. В отличие от этого, высоко-наклонный прокатилась плитка техника произвела это изображение.
Изображение HIST показывает меньше фона по сравнению с изображением Epi. ДНК находится в 3D гидрогеле, а длина волны возбуждения составляет 638 нанометров. Вот Epi изображение помечены эукариотического перевода удлиняемый фактор 2.
Изображение HIST улучшило соотношение сигнала к фону. Он также имеет более равномерное освещение. Оба имеют одинаковую мощность освещения 7,5 милливатт.
Скорость изображения была 2,5 кадров в секунду. Важно постоянно держать высокий наклонный угол и синхронизировать широкое зеркало с считыванием камеры. Это гарантирует высокое соотношение сигнала к фону при получении изображения.
Мы ожидаем, что микроскопия HIST принесет пользу нескольким приложениям, включая визуализацию супер-разрешения на более глубоких глубинах изображений и высокопрофильное профилирование экспрессии генов в толстых ломтиках тканей.
