Unsere Methode ermöglicht es uns, einzelne Moleküle mit einer 40-mal größeren Bildfläche als herkömmliche Methoden zu visualisieren und hat ein stark reduziertes Hintergrundsignal. Im Gegensatz zu anderen Techniken verwendet unser Ansatz eine einzelne Objektivlinse, benötigt keine spezielle Probenkammer und ist problemlos mit kommerziellen Mikroskopsystemen kompatibel. Nach dem Sammeln der notwendigen Komponenten beginnen Sie mit dem Aufbau des Systems.
Hier sind bereits einige Elemente auf der Bank positioniert. Auf einem Aluminiumblock ist ein Mikroskopkörper mit Piezo-Bühne und Probenhalter montiert. Auf der Bank befinden sich auch drei Laser und optische Elemente, um die Strahlen zu kombinieren.
Die kombinierten Träger werden so effizient wie möglich an eine Ein-Modus-Faser gekoppelt. Als letzten Vorschritt eine kollimierte Lichtquelle in einem Käfigsystem zusammenbauen. Dies verfügt über eine temporäre kohärente Lichtquelle, die mit einer Single-Mode-Faser, einem Faseradapter, einer achromatischen Linse und einer Iris verbunden ist.
Beginnen Sie mit der Arbeit mit dem Erkennungspfad. Platzieren Sie zunächst die kollimierte Lichtquelle im Objektivport des Mikroskopkörpers. Passen Sie den Spiegel unter den Zielen so an, dass der Ausgangsstrahl grob horizontal und an den Löchern der Bank ausgerichtet ist.
Fügen Sie einen dichroitischen Spiegel in den Strahlpfad ein und reflektieren Sie den Strahl um 90 Grad. Fügen Sie Spiegel hinzu, um den Pfad des übertragenen Strahls an eine sCMOS-Kamera zu beschaffen. Verwenden Sie die Spiegel, um sicherzustellen, dass der Strahl in die Mitte des Chips trifft.
Als nächstes legen Sie ein 300-Milliliter Brennweite Rohrobjektiv etwa eine Brennweite von der Kamera. Entfernen Sie die kollimierte Lichtquelle aus dem Mikroskopkörper. Passen Sie dann die Position der Rohrlinse an, um ihre Brennebene einzustellen.
Beenden Sie die Einstellungen, wenn die Kamera das Muster an der Decke deutlich auflöst. Der Erkennungspfad wird in diesem Schaltplan dargestellt. Beachten Sie die Hinzufügung eines Multiband-Passfilters vor der Röhrenlinse für die mehrfarbige Fluoreszenz-Bildgebung.
Kehren Sie zum Mikroskopkörper zurück. Dort installieren Sie die kollimierte Lichtquelle im Objektivhalter neu. Legen Sie nach dem dichroitischen Spiegel einen Klappspiegel in den Pfad des reflektierten Strahls, um ihn um 90 Grad umzuleiten.
Entfernen Sie die kollimierte Lichtquelle aus dem Mikroskopkörper und platzieren Sie sie in der Nähe. Als nächstes legen Sie eine 400-Millimeter-Brennweite Linse mit etwa einer Brennweite aus dem Spiegel. Am Mikroskopkörper die Objektivlinse installieren.
Passen Sie dann die Position des Spiegels entlang der optischen Achse an. Beobachten Sie die Decke über dem Objektiv und stoppen Sie, wenn dort ein perfektes Airy-Plattenmuster gebildet wird. Entfernen Sie nun das Objektiv und installieren Sie die kollimierte Lichtquelle mit einer offenen Iris neu.
Bestimmen Sie, wo entlang des Balkenweges der Strahl am kleinsten ist, etwa 400 Millimeter vom Spiegel entfernt. Sobald der Punkt identifiziert ist, montieren Sie einen Spiegel dort, eine konjugierte Bildebene. Der Status der Einrichtung an dieser Stelle wird in diesem Schaltplan angezeigt.
Der soeben hinzugefügte Spiegel ist mit M5 beschriftet. Setzen Sie einen weiteren Spiegel ein, um den Strahl um 90 Grad zu reflektieren, und montieren Sie eine 150-Millimeter-Brennweite dahinter. Die Linse sollte 150 Millimeter von der konjugierten Bildebene entfernt sein. Nehmen Sie als nächstes vorübergehend die erste Linse im Anregungsstrahlweg weg.
Mit dieser Konfiguration finden Sie die Brennposition der zweiten Linse. Platzieren Sie einen einachsigen Galvospiegel an diesem Brennpunkt als konjugierte Hinterfokusebene. Geben Sie null Volt an den Galvospiegel und drehen Sie seinen Halter so, dass er den Strahl um 90 Grad reflektiert.
Als nächstes entlang des Balkenweges, platzieren Sie einen Faltenspiegel, der den Strahl bei 90 Grad reflektiert. Platzieren Sie die Linse 100 Millimeter entlang des Strahlwegs von der konjugierten Hinterfokusebene. Entfernen Sie erneut die kollimierte Lichtquelle aus der Mikroskophalterung.
Fügen Sie eine weitere 100-Millimeter-Kollimationslinse mit einem Faseradapter und Einer-Modus-Faser zusammen mit einer Iris hinzu. Dann verwenden Sie die Iris, Faser und Linse, um einen kollimierten Strahl durch das Bildgebungssystem zu senden. Als nächstes legen Sie eine zylindrische Linse von Brennweite 400 Millimeter kurz vor der letzten Kollimationslinse in den Strahlweg ein.
Verwenden Sie es, um den Strahl zu fokussieren. Legen Sie eine 50-Millimeter-Zylinderlinse 450 Millimeter vor die erste. Dies ist eine schematische Darstellung des endgültigen Setups mit den Erkennungs- und Erregungspfaden.
Die Leistung der drei Laser wird durch die Single-Mode-Faser in den Pfad gekoppelt. Zur Prüfung wird eine 3D-Hydrogelprobe vorbereitet. Diese besteht aus 20 Nanometer karminroten Perlen, die mit Hydrogel vermischt sind.
Am Aufbau die Hydrogelprobe in den Probenhalter stellen. Schalten Sie bei der Probenanregung den 638-Nanometer-Laser ein und stellen Sie seine Leistung auf weniger als ein Milliwatt ein. Richten Sie die Kamerasteuerungssoftware im internen Triggermodus ein und erfassen Sie Videos.
An dieser Stelle hat der Galvomotor null Volt aufgebracht. Positionieren Sie die Kamera so, dass sich das Bild in der Mitte des Objektivs befindet. Passen Sie als Nächstes den Spiegel an, der die Bildebene des Konjugats ist.
Drehen Sie den horizontalen Knopf auf dem Spiegel, um eine hochgeneigte Beleuchtung zu erreichen. Zeichnen Sie das Kachelbild wie im Beispielfluoreszenzbild von 3D-Hydrogel mit 20-Nanometer-Perlen auf. Die Waage beträgt 20 Mikrometer.
Fahren Sie fort, nachdem Sie Hardware und Software eingerichtet haben, um den Galvospiegel zu fegen. Dies ist die galvo Spiegel Sweep Software für das Setup. Ordnen Sie die vollständige Bildgebung im Sichtfeld an, indem Sie Vmin auf minus 500 Millivolt einstellen.
Stellen Sie dann Vmax auf 500 Millivolt ein. Wechseln Sie als Nächstes zur Kameraerfassungssoftware. Wählen Sie im Triggermodus Extern aus.
Klicken Sie im Dropdown-Menü LightScan PLUS auf Unten Als Auswählen, klicken Sie auf Geschwindigkeitssteuerung scannen. Bestimmte Steuerungsparameter können nun festgelegt werden. Geben Sie unter Fensterhöhe 180 Zeilen ein.
Geben Sie unter Belichtung 28 Millisekunden ein. Wenn Sie fertig sind, kehren Sie zur Spiegelsteuerungssoftware zurück. In der Spiegelsteuerung Software-Schalter auf 3D-Stacks ON. Geben Sie die Anzahl der Stapel und die Schrittgröße an.
Klicken Sie auf Video aufnehmen, um mit der Aufnahme von Bildern zu beginnen. Dies ist ein Beispiel für Epi-Bildgebung von einsträngiger markierter DNA. Im Gegensatz dazu erzeugte die hochgeneigte Gestrichkehrtis-Technik dieses Bild.
Das HIST-Bild zeigt weniger Hintergrund im Vergleich zum Epi-Bild. Die DNA befindet sich in einem 3D-Hydrogel, und die Anregungswellenlänge beträgt 638 Nanometer. Hier ist ein Epi-Bild mit beschrifteter eukaryotischer Translationsdehnungsfaktor 2.
Das HIST-Bild hat das Signal-Hintergrund-Verhältnis verbessert. Es hat auch eine gleichmäßigere Ausleuchtung. Beide haben die gleiche Beleuchtungsleistung von 7,5 Milliwatt.
Die Bildgeschwindigkeiten lagen bei 2,5 Bildern pro Sekunde. Es ist wichtig, ständig einen hohen Neigungswinkel zu halten und den Kehrspiegel mit der Kameraanzeige zu synchronisieren. Dies garantiert ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis bei der Bildaufnahme.
Wir erwarten, dass die HIST-Mikroskopie von mehreren Anwendungen profitieren wird, einschließlich der hochauflösenden Bildgebung in tieferen Bildtiefen und der Profilerstellung der Genexpression mit hohem Durchsatz in dicken Gewebescheiben.
