تخليق البروتين هو عرضة للخطأ. ومع ذلك، قد تكون الأخطاء التكيفية تحت الضغط الفسيولوجي. لقد أظهرنا سابقًا أن أخطاء الترجمة المحددة في الميكوبتريا تساهم في التسامح مع المضادات الحيوية.
القدرة على قياس معدلات الخطأ المحددة يسمح لنا لاستهداف هذه الآلية التكيفية البكتيريا. المزايا الرئيسية لهذه التقنيات هي كسب من وظيفة المراسلين يمكن أن تكون حساسة بشكل رائع في قياس معدلات الخطأ الصغيرة التي ليس من السهل الكشف عن طريق قياس الطيف الشامل. يسمح فحص Nluc/GFP بالفحص المتوسط الإنتاجية لأنه يتجنب التعامل المفرط والتحلل من البكتيريا.
ومن خلال هذا الإجراء، سيكون طالب الدكتوراه يوي منغ تشن. اليوم سنظهر إجراءات استخدام هذين المراسلين من خلال هذا الفيديو. للبدء ، تلقيح مليلترين من 7H9 المتوسطة مع سلالات مراسل من النوع البري والمتحولة.
يهز في 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين أو حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى المرحلة الثابتة. Aliquot وتمييع للحصول على OD في 600 نانومتر حول 0.5 إلى 1. ثم، إضافة ATC إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام لكل ملليلتر.
أضف فوراً جرعات مختلفة من الـ ksg إلى الثقافة وفقاً للمخطوطة لقياس آثارها على معدلات الترجمة الخاطئة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة أربع إلى ست ساعات. بعد ذلك، نقل الثقافات البكتيرية إلى أنبوب ملليلتر اثنين.
وطاردة مركزية في 3، 220 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ل بيليه أسفل البكتيريا. بعد خطوة الطرد المركزي ، تخلص من المابير الخارقة وعطّل البكتيريا عن طريق إضافة 40 ميكرولترات من 1x عازلة تحلل سلبية. نقل lysuspended البكتيرية إلى لوحة بيضاء 96 جيدا، بئر واحد لكل عينة، ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
إضافة 80 ميكرولترات من الركيزة اليراعات إلى كل بئر. يهز لمدة 15 ثانية وقياس الإنارة من قبل مضيئة. ثم، إضافة 80 ميكرولترات من الركيزة رينيهلا إلى كل بئر.
يهز لمدة 15 ثانية وقياس الإنارة من قبل مضيئة. استخدم القيم المصححة لحساب معدلات الترجمة الخاطئة لكل شرط. للبدء، تلقيح مليلترين من 7H9 المتوسطة مع سلالة مراسل البكتيرية.
يهز في 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين أو حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى المرحلة الثابتة. ثم، والثقافة الفرعية في 50 ملليلتر من 7H9 المتوسطة وتنمو حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى المرحلة الثابتة في وقت متأخر. قبل أن تقتبس البكتيريا إلى لوحة 96-جيدا، إضافة ATC في تركيز النهائي من 50 نانوغرام لكل ملليلتر ويخلط جيدا.
إضافة 100 ميكروليتر في البئر إلى لوحة واضحة، مستديرة القاع 96-جيدا. بعد ذلك، أضف جرعات مختلفة من الـ ksg إلى آبار مختارة لفحص آثارها على معدلات الترجمة الخاطئة. إضافة 200 ميكرولترات من الماء المعقم إلى حافة آبار من لوحة للحد من التبخر من آبار العينة.
ختم لوحة، هز، والحث على العينات في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. استخدام ماصة متعددة القنوات لاتخاذ 80 ميكروليتر من كل بئر. نقل العينات إلى لوحة سوداء القاع 96-جيدا وقياس إشارة GFP بواسطة luminometer.
بعد قياس إشارة GFP، الطرد المركزي لوحة في 3، 220 مرات ز لمدة 10 دقائق. ثم، نقل 50 ميكرولترات من المابير إلى لوحة بيضاء القاع 96-جيدا. ثم، إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة Nluc إلى كل بئر.
اخلطي جيداً و قم بقياس الإنارة بواسطة المقياس الضوئي. وأخيراً، حدد نسبة Nluc/GFP بقسمة قيمة الإنارة Nluc المصححة على الفلورس GFP. في هذا العمل، تم استخدام نظام مراسل اليراينة لقياس معدل سوء الترجمة في وجود كاسوغاميسين في نوع البرية وفي سلالة من S.Smegmatis التي تم حذف KsgA.
وأظهرت النتائج طريقة واضحة تعتمد على الجرعة من Ksg تناقص معدل سوء الترجمة بينما في سلالة الحذف ksgA، كان Ksg أقل قوة وكان خط الأساس لمعدل سوء الترجمة أعلى بسبب مقاومة التعديل من قبل kasugamycin. كما تم قياس إجراءات كاسوغاميسين بشأن سوء الترجمة باستخدام مراسل Nluc/GFP. كل من رينايلا اليراعات ومراسل Nluc / GFP تنطوي على قياس نشاط لوسيفراز.
أخطاء الأنابيب الصغيرة يمكن أن يسبب تقلبات كبيرة في readouts. بالنسبة للمبتدئين ، نقترح زيادة عدد النسخ المتماثلة لكل تقليل فرصة الحصول على قراءات غير موثوق بها.
