هذا الداء الجرثومي الجزيئي السلي، يجيب على ثلاثة أسئلة رئيسية. واحد: ما هو حجم عبء المرض للمريض؟ 2: كيف يستجيب عبء المرض المريض للأدوية المضادة للسل؟
ثالثاً: ما هي العلاقة بين عبء المرض والاستجابة للعلاج؟ هذا الفحص ينتج نتيجة كمية من عبء مرض السل المريض، ويقيس كيف يتغير هذا العبء مع العلاج في وقت قصير. مع التعديل، يمكن تطبيق هذه المنهجية على مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى.
لقد قمنا بالفعل بتطوير تقنية مماثلة لتشخيص البكتيريا الفطرية غير الأنبوبية ، والبكتيريا المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن. عند تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، شاهد الفيديو ومارس الخطوات. من المهم جداً ممارسة مع العينات التي لا تحتاج إلى نتائج تشخيص المرضى.
العرض التوضيحي المرئي أمر بالغ الأهمية لأنه يبسط تعلم وإتقان الخطوات، خاصة تلك الأجزاء من الأسلوب التي يصعب شرحها في النص. ابدأ بإعداد ثقافات الخلايا. على مقعد مختبر نظيفة أو فئة مقصورة واحدة, حصاد aliquots ملليلتر واحد من المرحلة الأسية Bacille Calmette-Guerin أو ثقافة BCG في 15 أنابيب بلاستيكية ملليلتر وإغلاق بإحكام لهم.
عند إعداد عينات البلغم للمريض، والعمل في مساحة جيدة التهوية واتبع المبادئ التوجيهية في دليل GL One Stop TB. فتح بعناية كأس العينة والماصات واحد ملليلتر aliquots في 15 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية. ثم، بإحكام إغلاق الأنابيب.
نقل أنابيب العينة إلى عقد مغمورة في حمام مائي التي يتم تسخينها إلى 95 درجة مئوية، والتأكد من أن 3/4 من كل أنبوب مغمورة. تغلي العينات لمدة 20 دقيقة. ثم، نقل الأنابيب إلى مقاعد البدلاء لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
إجراء استخراج الحمض النووي الريبي في غطاء الدخان إذا استخدام مجموعة مع كلوروفورم الفينول أو الإيثانول عاصمة الورم. الإجراء RNA يتضح هنا هو إجراء استخراج الكلوروفورم الفينول. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام طرق بديلة لاستخراج الحمض النووي الريبي.
نقل aliquots ملليلتر واحد من العينة المعطلة الحرارة إلى 1.5 ملليلتر أنابيب وارتفاع 100 ميكرولترات من السيطرة الاستخراج في كل عينة. أغلق الأنابيب واخلطها عن طريق عكسها ثلاث مرات. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 20،000 مرات ز لمدة 10 دقيقة.
ثم، الطامح المابير، وترك 50 ميكرولترات من الرواسب. نحن تعليق الرواسب في 950 ميكرولتردات من عازلة تحلل عن طريق الأنابيب ونقل التعليق كله في أنابيب مصفوفة lysing الموردة مع عدة استخراج الحمض النووي الريبي. بإحكام إغلاق الأنابيب والتأكد من أنها وصفت على كل من الغطاء والجانب.
ثم، التجانس العينات لمدة 40 ثانية في 6،000 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي في 12، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه، إعداد أنابيب ملليلتر واحدة جديدة، وإضافة 300 ميكرولترات من الكلوروفورم.
استخدام ماصة ملليلتر واحد لpirate بعناية تعرق دون لمس مصفوفة lysing ونقلها إلى أنبوب مع الكلوروفورم. دوامة الأنابيب لمدة خمس ثوان وتركها لتسوية لمدة خمس دقائق أو حتى ثلاث مراحل واضحة للعيان. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 12،000 مرات ز لمدة خمس دقائق.
ثم، دقيق الماصة المرحلة العليا ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 500 ميكرولترات من الجليد البارد 100٪ الإيثانول إلى العينة، وإغلاق الأنبوب، وعكسه ثلاث مرات لخلط. احتضان الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم، تحميل الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير قبل المبردة والطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 13،000 مرات ز وأربع درجات مئوية. تجاهل كبرى، إضافة 500 ميكرولترات من 70٪ من الإيثانول البارد الجليد والطرد المركزي لمدة 10 دقائق أخرى في 13، 000 مرات ز. تجاهل كل المُندفعين.
واحتضان الأنابيب في 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتجفيف بيليه حمض النووي، والتأكد من الحفاظ على أنابيب مفتوحة جزئيا لتمكين تبخر الإيثانول. بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من المياه الحرة نواة إلى بيليه واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. دوامة العينة لمدة ثلاث ثوان والمضي قدما في إزالة الحمض النووي أو تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
أعد الحمض النووي مزيج واحد وفقا لتوجيهات المخطوطة والماصات 11 ميكرولترات في كل أنبوب يحتوي على مستخلص الحمض النووي الريبي. دوامة لمدة ثلاث ثوان وتدور لفترة وجيزة لإزالة أي قطرات من جدار الأنبوب. ثم، احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة ساخنة أو حاضنة.
بعد الحضانة، إضافة مصغرة واحدة إضافية من انزيم واحد للحمض النووي مباشرة إلى الأنبوب، واخلط جيدا من خلال دوامة. ثم، احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة أخرى في 37 درجة مئوية. ذوبان ودوامة كاشف تنشيط الحمض النووي.
ثم، إضافة 10 ميكرولترات لكل مستخلص الجيش الملكي النيبالي. و حضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق دوامة الأنابيب ثلاث مرات خلال خطوة الحضانة.
ثم، الطرد المركزي الخليط في 13،000 مرات ز لمدة دقيقتين ونقل بعناية فائقة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الجيش الملكي النيبالي الحرة، مع التأكد من عدم لمس أي من مصفوفة تعطيل. تمييع جميع عينات الحمض النووي الريبي غير معروف واحد إلى 10 في المياه الحرة الجيش الملكي النيبالي ثم، مزجها عن طريق دوامة لمدة خمس ثوان والغزل لفترة وجيزة لهم باستمرار. ذوبان MTB وعينات EC-RNA وجعل سبعة وستة أضعاف التخفيفات على التوالي لمنحنى القياسية.
إعداد RT زائد وRT ناقص PCR الماجستير يمزج وفقا لاتجاهات المخطوطة. دوامة RT زائد مزيج ونقل 16 ميكروليتر في كل RT بالإضافة إلى أنبوب PCR. ثم، دوامة المزيج الرايت ناقص وإضافة 16 ميكرولترات في كل RT ناقص أنبوب PCR.
إضافة أربعة ميكروليتر من استخراج الحمض النووي الريبي أو الماء ومكررة لRT زائد أنابيب. المياه هي التحكم غير القالب أو المجلس الوطني الانتقالي. إضافة أربعة ميكروليتر من مستخلص الحمض النووي الريبي أو الماء إلى أنابيب الرايت ناقص.
قم بتحميل أنابيب التفاعل في جهاز PCR في الوقت الحقيقي، قم ببرمجة التفاعل كما هو موضح في المخطوطة، ثم قم بتشغيل التفاعل. لتفسير استجابة العلاج، استخدم المنحنى القياسي لتحويل قيم CQ إلى حمولة بكتيرية وحساب الاستجابة كتغيّر في الحمل البكتيري خلال فترة متابعة العلاج. يعني انخفاض الحمل البكتيري بعد العلاج استجابة إيجابية في حين أن أي تغيير أو ارتفاع في الحمل البكتيري يعني استجابة سلبية.
للتحقق من أن جميع عصيات السل M.السل كانت غير مُبطلة للحرارة، تم قياس الكثافة البصرية للخلايا ومقارنتها بالخلايا الحية. ولم يلاحظ أي تغير في المواد المستنفدة للأوزون بمرور الوقت للعينات المعطلة للحرارة التي تشير إلى عدم حدوث نمو. تم احتضان عينات الحرارة المعطلة في 37 درجة مئوية لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي يتحلل بعد تعطيل الحرارة للخلايا.
لم يتم العثور على أي فرق بين الحمض النووي الريبي حصاده مباشرة بعد تنشيط الحرارة، وعزلت الجيش الملكي النيبالي واحد، اثنين، ثلاثة، وبعد أربعة أيام في كل من الثقافات BCG والسل البلغم إيجابية. عندما تم إضافة إنزيم RNA A بشكل خارجي إلى العينات ، قبل وبعد تنشيط الحرارة ، حدث فقدان الحمض النووي الريبي في جميع العينات المعطلة للحرارة عبر أربعة أيام من الحضانة. تم قياس تأثير التفكّك الحراري على الحمض النووي الريبي في ثقافات BCG والبلغم من المرضى إيجابيين السل.
وكان الحمل البكتيري المقاس لثقافة التحكم أعلى من الحمل البكتيري المشترك لثقافة الحرارة المعطلة عند 80 درجة مئوية و85 درجة مئوية و95 درجة مئوية لكل من عينات BCG والبلغم. يؤدي تعطيل الحرارة للعينات إلى الحد الأدنى من فقدان الحمض النووي الريبي ، مما يترك RNA كافية للسل المصب MBLA وغيرها من الاختبارات الجزيئية المصب. تم استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال للتحقق مما إذا كانت الخلايا قد تم تنشيطها بسبب تنشيط الحرارة.
كشف فحص الخلايا في التكبير السفلي والعليا جدران الخلايا سليمة والهيئات الدهنية داخل الخلايا مرئية. بدت الخلايا ممدود، ولكن ليس مُمدوداً. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن إضافة السيطرة على استخراج، الذي يتحكم في أي نتائج سلبية كاذبة بسبب ضعف استخراج الحمض النووي الريبي.
ويمكن تطبيق هذا النهج على البكتيريا المرتبطة بمرض الانسداد الرئوي المزمن، وعدوى الميكوبباكتريا غير الأنبوبية، وغيرها من مسببات الأمراض التنفسية. وقد مكنت النتائج الكمية من السل MBLA الرياضية و الدوائية النمذجة لكيفية استجابة المرضى لعلاج السل. ونحن نتطلع إلى تطبيق هذه التقنية في الرعاية الروتينية حيث يتم إدارة مرضى السل.
