Синтез белка подвержен ошибкам. Однако ошибки могут быть адаптивными при физиологическом стрессе. Ранее мы показали, что специфические ошибки перевода в микобактериях способствуют толерантности к антибиотикам.
Возможность измерять конкретные показатели ошибок позволяет нам ориентироваться на этот бактерий адаптивный механизм. Основными преимуществами этих методов являются выгоды от функции репортеры могут быть изысканно чувствительны в измерении небольших ошибок, которые не легко обнаружить с помощью масс-спектрометрии. Анализ Nluc/GFP позволяет проводить скрининг средней пропускной способности, так как позволяет избежать чрезмерной обработки и лиза бактерий.
Демонстрацией процедуры будет аспирант Yue-Meng Chen. Сегодня мы продемонстрируем процедуру использования этих двух репортеров через это видео. Для начала прививка двух миллилитров среды 7H9 с диким типом и мутировавшими микобактериальными штаммами репортера.
Встряхните при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух дней или до тех пор, пока ОД на 600 нанометров не достигнет стационарной фазы. Aliquot и разбавить, чтобы получить OD на 600 нанометров около 0,5 до 1. Затем добавьте УВД к окончательной концентрации 50 нанограмм на миллилитр.
Немедленно добавьте различные дозы ksg к культуре согласно рукописи для того чтобы измерить свое влияние на тарифы mistranslation. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию при встряхивании в течение четырех-шести часов. Затем перенесите бактериальные культуры в двухми миллилитровую трубку.
И центрифуга при температуре 3 220 г при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать бактерии. После шага центрифугации, отбросить супернатант и нарушить бактерии, добавив 40 микролитров 1x пассивного буфера лиза. Передача повторного бактериального лисата на белый 96-хорошо пластины, один хорошо на образец, и встряхнуть при комнатной температуре в течение 20 минут.
Добавьте 80 микролитров светлячкового субстрата к каждой колодец. Встряхните в течение 15 секунд и измерить люминесценцию с помощью люминометра. Затем добавьте 80 микролитров субстрата Renilla к каждой колодец.
Встряхните в течение 15 секунд и измерить люминесценцию по люминометру. Используйте исправленные значения для расчета тарифов неправильного перевода каждого состояния. Для начала, привить два миллилитров 7H9 среды с бактериальным штаммом репортера.
Встряхните при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух дней или до тех пор, пока ОД на 600 нанометров не достигнет стационарной фазы. Затем субкультура в 50 миллилитров 7H9 среды и расти до OD на 600 нанометров достигает поздней стационарной фазы. Перед aliquoting бактерий на 96-хорошо пластины, добавить УВД в окончательной концентрации 50 нанограмм на миллилитр и хорошо перемешать.
Добавьте 100 микролитров на колодец к ясной пластине с круглым дном 96-колодец. Далее добавьте различные дозы ksg к выбранным скважинам, чтобы ознать его влияние на скорость неправильного перевода. Добавьте 200 микролитров стерильной воды в краевые скважины пластины, чтобы ограничить испарение из выборочных скважин.
Печать пластины, встряхнуть, и вызвать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 16 до 20 часов. Используйте многоканарновую пипетку, чтобы взять 80 микролитров из каждой колодец. Перенесите образцы на черно-дном 96-хорошо пластины и измерить сигнал GFP по люминометру.
После измерения сигнала GFP, центрифуга пластины на 3, 220 раз г в течение 10 минут. Затем перенесите 50 микролитров супернатанта на пластину с белым дном. Затем добавьте 50 микролитров субстрата Nluc к каждой колодец.
Хорошо смешайте и измерьте люминесценцию с помощью люминометра. Наконец, определите соотношение Nluc/GFP, разделив скорректированное значение люминесценции Nluc на флуоресценцию GFP. В этой работе система репортеров Renilla firefly использовалась для измерения скорости неправильного перевода в присутствии касугамицина в диком типе и в штамме S.Smegmatis, который был удален ksgA.
Результаты показали четкую дозу зависимых образом ksg снижение скорости неправильного перевода в то время как в ksgA-удаление штамма, ksg был менее мощным и базовый уровень неправильного перевода был выше из-за устойчивости к модуляции kasugamycin. Действия Касугамицина по неправильному переводу были также измерены с помощью репортера Nluc/GFP. Оба Renilla светлячок и Nluc / GFP репортер включать измерения активности люциферазы.
Небольшие ошибки пипетки могут вызвать большие колебания в считываниях. Во-первых, мы предлагаем увеличить количество каждого репликации, чтобы свести к минимуму вероятность получения ненадежных считывания.
