الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

Drosophila بمثابة نظام نموذج جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا نقدم بروتوكول لقياس نشاط citrate synthase في تجانس الأنسجة من الذباب الكبار. لا يتطلب هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا.

وهو سريع وبسيط ومناسب لقياس نشاط سيترات سينثاز في اليرقات والخلايا المستزرعة والأنسجة الثديية. ابدأ بجمع الذباب البالغ لكل عينة، مع التأكد من جمع عينات ثلاثية على الأقل لكل نمط جيني. إعداد 500 ميكرولتردات من الجليد الباردة استخراج العازلة مع 20 ملليمتر HEPES، واحد ملليمولار EDTA، و 0.1٪ triton X-100 في أنبوب اختبار 1.5 ملليلتر لكل عينة.

تخدير الذباب البالغ مع ثاني أكسيد الكربون على وسادة التخدير. لعزل الصدر، وإصلاحها مع زوج من ملقط وعزل البطن ذبابة عن طريق قطع على طول الحدود من الصدر والبطن مع زوج من مقص. جمع thoraxes ذبابة لcitrate synthase النشاط المقايسة.

نقل 10 الكبار تطير الصدر إلى 100 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج العازلة على الفور وتجانس لهم مع آفة على الجليد. الحفاظ على العينات الباردة عن طريق التجانس لمدة خمس إلى 10 ثوان على الجليد، والسماح لهم الجلوس على الجليد لمدة خمس ثوان، ثم تكرار حتى يتم تجانس جميع الأنسجة تماما. Aliquot 10 ميكرولترات من كل عينة متجانسة إلى أنبوب جديد لقياس محتوى البروتين ، والحفاظ على هذه الأنابيب على الجليد كذلك.

إضافة 400 ميكرولتردات من الجليد الباردة استخراج العازلة لكل عينة المتبقية لحجم إجمالي 500 ميكرولترس وماصات صعودا وهبوطا بلطف لخلط. لكل رد فعل، إضافة ميكرولتر واحد من الخلايا المخففة إلى 150 ميكرولترات من حل رد الفعل الطازجة. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف، مع التأكد من تجنب تشكيل فقاعة، ثم استخدام قارئ لوحة لقياس امتصاص في 412 نانومتر كل 10 إلى 30 ثانية لمدة أربع دقائق في 25 درجة مئوية.

رسم البيانات على أنها امتصاص على مر الزمن، ثم حساب الميل للجزء الخطي من المنحنى. وأخيراً، قم بتقسيم معدل التفاعل أو المنحدر حسب تركيز البروتين العينة لتطبيع نشاط سيترات سينثاز. كان من المفترض أن الضربة القاضية من dRNF34 في العضلات Drosophila من شأنه أن يزيد من نشاط سينثاز سيتايثاز الميتوكوندريت في حين أن الضربة القاضية من dPGC-1 من شأنه أن يعكس هذه الزيادة.

تم تحديد معدل انزيمي خطي أولي لكل مقايسة؛ تمثل منحدرات خطوط الاتجاه معدلات التفاعل القصوى التي تعادل أنشطة سينتاناز السيترات القصوى للنمط الجيني المختلف. تم حساب أنشطة سينثاز سيترات القصوى من المنحنيات الحركية وتم تطبيعها حسب تركيز البروتين. وأظهرت النتائج أن نشاط synthase من الصدر يطير في الواقع زيادة مع العضلات الخاصة dRNF34 الضربة القاضية والزيادة انعكست عن طريق ضربة قاضية dPGC-1 العضلات المحددة.

عند تجانس العينة ، من المهم أن تقلب الأنبوب وتتحقق من التجانس للتأكد من عدم وجود جلطات وأن الأنسجة في الأنبوب متجانسة تمامًا. بعد جمع العينات، يجب إجراء جميع العلاجات العينة على الجليد. يتم استخدام مقايسة نشاط سينثاز سيترات لتحديد كتلة الميتوكوندريا سليمة.

يعد القياس الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا السليمة مهمًا جدًا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا.