3D الطباعة البيولوجية مع البكتيريا هي تقنية وضعت حديثا. يوفر هذا البروتوكول طريقة سهلة لبناء الأغشية الحيوية 3D المهندسة المطبوعة مع البكتيريا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على إنتاج الأغشية الحيوية المطبوعة ثلاثية الأبعاد باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد منزلية الصنع.
أحد التطبيقات الممكنة للطابعة ثلاثية الأبعاد لدينا هو إنشاء أغشية بيو فيلمية نموذجية قابلة للاستنساخ يمكن استخدامها لتطوير علاجات جديدة مضادة للبكتيريا. يمكن تطبيق نهج الطباعة ثلاثية الأبعاد لدينا على أي نوع من البكتيريا المتوافقة مع bioink لدينا alginate على أساس. إعداد bioink وركائز الطباعة هي إجراءات قياسية إلى حد ما ، في حين أن عملية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، وخاصة معايرة المحور Z هو خطوة حاسمة تتطلب بعض الممارسة.
سوف تؤثر معايرة مجموعة ارتفاع الوصول على دقة طابعة 3D لدينا، وتعتمد بشدة على الخبرة الشخصية. يتطلب هذا الإجراء تعديلات يدوية، ومن الصعب وصفه في شكل مكتوب. قم بتوصيل طرف ماصة 200 ميكرولتر بطول أنابيب السيليكون، واركب رأس الطارد الخاص بالطابعة ثلاثية الأبعاد كبديل للطارد الأصلي.
بعد ذلك، إضافة أربعة ملليلترات من محلول كلوريد الكالسيوم المولر خمسة إلى 400 ملليلتر من 1٪ أجار الذائبة في مرق لوريا-بيرتاني، وتكمله بالمضادات الحيوية والمستحثات المناسبة. ثم، الاستغناء 20 ملليلتر من حل أجار LB في كل 150 ملليمتر من قبل 15 ملليمتر طبق بيتري. جفف الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء نصف مفتوح.
إعداد محلول ألجينات الصوديوم 3٪، وتسخينه إلى نقطة الغليان ثلاث مرات لتعقيم المحلل. ثم، وتخزين محلول معقمة في أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامه. لإعداد المكون البكتيري من bioink، تنمو البكتيريا القولونية E.coli تحمل plasmids للتعبير GFP التأسيسية في 50 ملليلتر من LB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية.
هز الثقافة في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد نمو بين عشية وضحاها من الثقافة، بيليه البكتيريا لمدة خمس دقائق في 3، 220 مرة الجاذبية ومن ثم إزالة supernatant. Resuspend بيليه البكتيريا في 10 ملليلتر من متوسطة LB، وإضافة 10 ملليلتر من 3٪الصوديوم.
قم بتوصيل الطابعة ثلاثية الأبعاد بجهاز كمبيوتر، وافتح برنامج الطباعة ثلاثية الأبعاد. انقر فوق الزر الصفحة الرئيسية لمحور X وY و Z لنقل رأس الطباعة إلى موضعه المنزلي. لكل طباعة، ضع ركيزة طباعة جاهزة على موقع معين على سرير الطباعة.
رفع رأس الطباعة إلى ارتفاع أكثر من 22 ملليمتر تحت السيطرة اليدوية، بحيث أنها لن تصطدم مع حافة طبق بيتري أثناء الحركة. ضع رأس الطباعة فوق الجزء العلوي من اللوحة واحركه لأسفل حتى يتصل طرف الماصات بسطح الطباعة. تعيين هذا الموضع محور Z كـ Z1، ارتفاع سطح الطباعة.
بعد ذلك، ارفع رأس الطباعة واحركه يدويًا خارج منطقة اللوحة. إذا كانت مسافة العمل بين رأس الطباعة وسطح اللوحة معرّفة على أنها Z2، أدخل ارتفاع سطح الطباعة بالإضافة إلى مسافة العمل في برنامج الطباعة كقيمة Z أثناء الطباعة. قم بتحميل ملف G-code مبرمج مسبقاً يحتوي على أوامر لطباعة الشكل المطلوب.
في كل سطر أوامر، قد يتم تغيير موضع رأس الطباعة في المحاور س و ص أو Z. تأكد من إدخال قيمة Z أثناء جميع خطوات الطباعة كطول سطح الطباعة بالإضافة إلى مسافة العمل. تحميل bioink السائل في المحاقن وجبل لهم في مضخة حقنة من 3D bioprinter.
ثم، تعيين سرعة البثق إلى 0.3 ملليلتر في الساعة. اطبع bioink على ركيزة الطباعة بالنقر فوق الزر طباعة. انتظر لبدء ضخ الحقنة حتى بعد بدء الطباعة، وقبل أن يتلامس رأس الطباعة مع سطح الطباعة.
أثناء الطباعة، التحكم في حركة رأس الطباعة بالكامل من قبل البرنامج. وقف مضخة حقنة بمجرد وصول رئيس الطباعة في النقطة الأخيرة من الطباعة، وإلا سوف بيوينك الزائدة إسقاط على الركيزة الطباعة والحد من قرار الطباعة. لبناء هياكل 3D، يتم التحكم في جميع حركات رأس الطباعة في محرر G-code.
لزيادة ارتفاع الطباعة للطبقة الثانية، اكتب في ارتفاع الطباعة للطبقة الأولى، ثم قم بزيادة قيمة Z في الكود بمقدار 0.2 مليمتر. بعد ذلك، زيادة قيمة Z بمقدار 0.1 ملليمتر، عند الانتقال إلى طبقة أعلى. احتضان العينات المطبوعة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة إلى ستة أيام للسماح بإنتاج مكونات بيو فيلم مثل ألياف كيرلي.
ثم ضع اللوحة على ماسح ضوئي فلوري وصور اللوحات. لإذابة مصفوفة ألجينات، إضافة 20 ملليلتر من محلول سيترات الصوديوم 0.5 ضرس في 7، إلى الركيزة المطبوعة. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في حين تهتز في 30 دورة في الدقيقة.
ثم، والتخلص من السائل وصورة لوحات مرة أخرى، للمقارنة مع الصور لوحات قبل وبعد العلاج سيترات. يمكن للطبعة الحيوية ثلاثية الأبعاد إنشاء بكتيريا تغلف الهيدروجيلات في مجموعة متنوعة من الأشكال ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الأشكال المطبوعة لتقييم ما إذا كان تكوين بيو فيلم ناجحا أو إذا تم حل مصفوفة الجينات تماما باستخدام محلول سيترات الصوديوم.
في حالة bioink دون إنتاج كيرلي غير قابل للذوبان ، تم حل النمط المطبوع تمامًا بعد علاج سترات الصوديوم ، مما يدل على أنه لم تتشكل أي شبكة بيوليمم كيرلي. لم يتم حل البكتيريا التي تحتوي على إنتاج كيرلي غير قابل للذوبان بعد علاج سترات الصوديوم ، مما يشير إلى أن البكتيريا المطبوعة كانت قادرة على تشكيل شبكة كيرلي واسعة بما يكفي لتثبيت النمط المطبوع للبكتيريا. لبناء هياكل متعددة الطبقات، يمكن طباعة طبقات إضافية عن طريق التحكم في محرر رمز G.
زيادة عدد الطبقات المطبوعة في نموذج تسبب في زيادة عرض وارتفاع البنيات المطبوعة بشكل متزايد. عندما تم طباعة E.coli المهندسة لإنتاج إيندوشيبلي بروتينات كيرلي في هياكل متعددة الطبقات، لم يتم حل علاج سترات الصوديوم العينات، في حين تم حل الهياكل متعددة الطبقات التي تحتوي على غير كورلي المنتجة E.coli. الأجزاء الأكثر أهمية من إجراءات الطباعة 3D هي معايرة Z-محور، وتنسيق بدء الطباعة وبدء ضخ الحقن.
bioink وضعت لهذه العملية لينة إلى حد ما ، مع صلابة منخفضة. ويمكن إجراء مزيد من التعديل على bioink، من أجل توفير وتحسين الاستقرار الميكانيكية. هذه التقنية الطباعة 3D تمكن إنتاج الأغشية الحيوية مع خصائص ميكانيكية ممتازة، والتي قد تمكن من تصنيع المواد الحيوية.
عند التعامل مع هذه البكتيريا، وارتداء الحماية المناسبة، مثل القفازات.
