3D биопечать с бактериями является недавно разработанной техникой. Этот протокол обеспечивает простой способ построения инженерных биопленок 3D напечатаны с бактериями. Основным преимуществом этой техники является возможность производства 3D печатных биопленок с помощью недорогого домашнего 3D принтера.
Одним из возможных применений нашего 3D принтера является создание воспроизводимых моделей биопленок, которые могут быть использованы для разработки новых антибактериальных методов лечения. Наш подход к 3D-печати может быть применен к любому типу бактерий, которые совместимы с нашим биоинком на основе альгината. Подготовка биоотвода и печатных субстратов является довольно стандартными процедурами, в то время как процесс 3D-печати, особенно калибровка оси З, является важным шагом, который требует некоторой практики.
Калибровка высоты набора доступа будет влиять на разрешение нашего 3D принтера, и сильно зависит от личного опыта. Эта процедура требует ручных корректировок, и ее трудно описать в письменном формате. Подключите 200 микролитровый наконечник пипетки к длине силиконовых труб, и смонтировать наконечник пипетки на экструдер голову 3D принтера в качестве замены для оригинального экструдера.
Затем добавьте четыре миллилитров раствора хлорида молярного кальция в 400 миллилитров 1%агара, растворенного в бульоне Лурия-Бертани, и дополните его соответствующими антибиотиками и индукторами. Затем разбей 20 миллилитров раствора LB-агара в каждую 150-миллиметровую чашку Петри на 15 миллиметров. Высушите блюдо в течение 30 минут при комнатной температуре, с крышкой наполовину открытым.
Приготовьте раствор альгината натрия 3%натрия и нагрейте его до кипения три раза, чтобы стерилизовать раствор. Затем храните стерильный раствор при четырех градусах Цельсия, пока он не будет использован. Чтобы подготовить бактериальный компонент биоинк, вырастить бактерии E.coli проведения плазмидов для составного экспрессии GFP в 50 миллилитров LB среды, содержащей антибиотики.
Встряхните культуру при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию за одну ночь. После ночного роста культуры, гранулы бактерий в течение пяти минут в 3, 220 раз тяжести, а затем удалить супернатант. Resuspend бактерии гранулы в 10 миллилитров LB среды, и добавить 10 миллилитров 3%натрия альгината.
Подключите 3D-принтер к компьютеру и откройте программное обеспечение для 3D-печати. Нажмите кнопку «Домой» для осей X, Y и q, чтобы переместить печатную головку в домашнее положение. Для каждого отпечатка поместите подготовленный печатный субстрат на определенное место на печатной кровати.
Поднимите печатаную головку на высоту более 22 миллиметров под ручным управлением, чтобы она не столкнулась с краем чашки Петри во время движения. Распоить печатаную головку поверх пластины и перемещать ее вниз до тех пор, пока наконечник пипетки не свяжется с поверхностью печати. Присвоите это положение оси no1, высоту поверхности печати.
Затем поднимите печатаную головку и вручную перемести ее за пределы области пластины. Если рабочее расстояние между печатной головой и поверхностью пластины определяется как No2, введите высоту поверхности печати плюс рабочее расстояние в программу печати в качестве значения q во время печати. Загрузите заранее запрограммированный файл G-кода, содержащий команды для печати нужной формы.
На каждой командной строке положение печатной головки может быть изменено в осях X, Y и q. Не забудьте ввести значение q во время всех этапов печати как высота поверхности печати плюс рабочее расстояние. Загрузите жидкое биоинку в шприцы и смонтировать их в шприц-насосе 3D биопринтера.
Затем установите скорость экструзии до 0,3 миллилитров в час. Печать биоинк на печать субстрата, нажав кнопку печати. Подождите, чтобы начать шприц насос до тех пор, пока после начала печати, и до печати головка вступает в контакт с поверхностью печати.
Во время печати, контролировать движение печати головы полностью с помощью программного обеспечения. Остановите шприц-насос, как только печатная головка прибудет в последнюю точку печати, в противном случае избыток биоотвода упадет на печатный субстрат и уменьшит разрешение печати. При строительстве 3D-конструкций все движения печатной головки контролируются в редакторе G-кода.
Чтобы увеличить высоту печати для второго слоя, ввемите высоту печати первого слоя и увеличьте значение q в коде на 0,2 миллиметра. После этого увеличьте значение q на 0,1 миллиметра при перемещении к более высокому слою. Инкубировать печатные образцы при комнатной температуре в течение трех-шести дней, чтобы обеспечить производство компонентов биопленки, таких как волокна Curli.
Затем поместите пластину на флуоресцентный сканер и изображение пластин. Чтобы растворить альгинатную матрицу, добавьте 20 миллилитров раствора цитратов натрия 0,5 моляра при рН 7 к печатаемому субстрату. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов при встряхивании при 30 об/мин.
Затем, отбросить жидкость и изображение пластин снова, чтобы сравнить с изображениями пластин до и после лечения цитратом. 3D биопринтер может создавать бактерии, инкапсулирующие гидрогели в различных двумерных и трехмерных формах. Эти печатные формы могут быть использованы для оценки того, является ли образование биопленки было успешным, или если альгинат матрицы полностью растворяется с помощью раствора цитрата натрия.
В случае биоинк без неопроизводимой плазмиды производства Curli, печатный узор был полностью растворен после лечения цитратом натрия, что означает, что не сформировалась сеть биопленки Curli. Бактерии, содержащие неопроизводимую плазмиду производства Curli, не растворялись после лечения цитратом натрия, что указывает на то, что напечатанные бактерии смогли сформировать сеть Curli достаточно обширной, чтобы стабилизировать печатную структуру бактерий. Для построения многослойных структур можно распечатать дополнительные слои, контролируя редактор G-кода.
Увеличение количества печатных слоев в образце привело к постепенной увеличению ширины и высоты печатных конструкций. Когда E.coli инженерии для inducibly производить Белки Curli были напечатаны в многослойных структур, лечения цитратом натрия не растворяют образцы, в то время как многослойные структуры, содержащие не Curli производства E.coli были растворены. Наиболее важными частями процедуры 3D-печати являются калибровка оси И, а также координация запуска печати и запуска шприц-насоса.
Биоинк, разработанный для этого процесса, довольно мягкий, с низкой прочностью. Для обеспечения и улучшения механической устойчивости биоутмов можно было бы внести дальнейшие изменения в биоинку. Этот метод 3D-печати позволяет изготавливать биопленки с отличными механическими свойствами, что может позволить изготовить биомиметические материалы.
При обращении с этими бактериями, носить надлежащую защиту, такие как перчатки.
