يسمح بروتوكولنا للباحثين بإنشاء شبكات أوعية هرمية داخل رفرف مصمم بالكامل وقابل للزرع ، مما مهد الطريق لإجراء دراسات جديدة حول سلوك الأوعية الدموية تحت التكامل في الجسم الحي. جمعت هذه التقنية بين براعة تقنيتين للطباعة 3D لإنشاء وتجميع الأوعية على الميكرو والميزوسكال التي يمكن مفاغرتها مباشرة مع الأوعية المضيفة باستخدام الجراحة المجهرية. يمكن استخدام اللوحات الوعائية المصممة بالكامل لعلاج عيوب الأنسجة الكبيرة وكذلك لتوفير منصة لدراسة تطورات الأنسجة وتكاملها.
يمكن توسيع الطرق المقترحة لدراسة دمج الخلايا الخاصة بالأنسجة ، وكذلك لتقييم استخدام الحبر الحيوي والمواد الداعمة المختلفة. ابدأ بملء قالب BVOH ب 30 ميكرولتر من محلول البوليمر. قم بالطرد المركزي للقالب عند 100 مرة جم لمدة دقيقتين وقم بتعبئة القالب ب 20 ميكرولتر أخرى من محلول البوليمر لضمان الملء الكامل.
قم بتجميد القوالب المملوءة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان تجميد جميع محلول البوليمر. قم بإزالة المذيب من القوالب عن طريق تجميدها بين عشية وضحاها. لإزالة مادة قالب الأضحية ، انقل القوالب بعد عملية التجفيف بالتجميد إلى حمام مائي منزوع الأيونات سعة 5 لترات تحت تحريك لطيف.
استبدل الماء في الحمام عندما يصبح غائما. عندما يذوب كل BVOH ، جفف السقالات في الهواء وتخزينها في غرفة فراغ حتى الاستخدام. انقل ما يقرب من 4 ملليلترات من مواد الدعم المضغوطة المعدة إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا باستخدام ماصة إزاحة إيجابية.
اضغط على صفيحة البئر على سطح صلب لإجبار مادة الدعم على الانتشار بالتساوي في البئر. قم بإعداد تعليق يحتوي على 2 مليون HAMEC-ZsGreen و 6 ملايين خلية جذعية لب الأسنان في 10 ملليلتر من وسط الخلايا البطانية. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 مرة جم لمدة 4 دقائق للحصول على بيليه خلوي ، ثم قم بشفط الوسط الفائق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 ملليلتر من الحبر الحيوي rhCollMA للحصول على حبر حيوي بتركيز إجمالي للخلية يبلغ 8 ملايين خلية لكل 1 ملليلتر من الحبر الحيوي.
قم بتركيب إبرة قطرها الداخلي 0.22 ملم في خرطوشة طباعة كهرمانية سعة 3 ملليلتر وضع الخرطوشة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. انقل 1 ملليلتر من خليط الخلايا والحبر الحيوي إلى خرطوشة الطباعة عن طريق ملئها من الأعلى باستخدام ماصة إزاحة إيجابية لتقليل الفقاعات. قم بتركيب خرطوشة الطباعة في الأداة المناسبة في الطابعة الحيوية.
ارسم نمطا ثنائي الأبعاد لمربع 4 ملليمتر يحتوي على قناة دائرية قطرها 2 ملم في وسطها. بثق الرسم بمقدار 4 ملليمترات للحصول على مكعب 4 ملم مع قناة مركزية. تصدير هذا الكائن كملف STL.
قم باستيراد قالب STL بلوحة 12 بئرا إلى علامة تبويب النمذجة الصلبة في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية وضعه في المنطقة المخصصة من سرير الطباعة الافتراضي. قم باستيراد ملف STL الخاص بالشكل المكعب إلى علامة تبويب النمذجة الصلبة في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية. انقر فوق خانة الاختيار استخدام مقسم طريقة العرض الخارجية متبوعا بتكوين مقسم طريقة العرض ضمن قسم خاصية الكائن.
في النافذة المنبثقة، اختر نمطا مستقيما لنمط التعبئة واكتب 30٪ في كثافة التعبئة، انقر فوق قبول. انقر على المكعب وحركه باستخدام الماوس لوضع نسخة من شكل المكعب في كل بئر افتراضي مطلوب. انقر فوق الزر "إضافة مادة" في علامة التبويب "المواد" في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية لإنشاء إعدادات مواد جديدة للحبر الحيوي rhCollMA.
اختر إعدادات المواد للطباعة. للضغط ، اكتب 2 رطل لكل بوصة مربعة ، وللسرعة اكتب 20 ملم في الثانية في المربعات المقابلة. قم بتعيين قيم عرض الخط وارتفاع الخط إلى 0.24 ملم، وقيمة التسارع إلى 400 ملم لكل ثانية مربعة.
في علامة التبويب النمذجة الصلبة ، انقر فوق كائن المكعب ثم انقر فوق مادة rhCollMA من قسم المواد لتعيينها إلى شكل المكعب. في علامة التبويب التجميع الحيوي ، انقر فوق الزر إرسال مهمة الطباعة لإرسال مهمة الطباعة إلى الطابعة الحيوية. قم بتحميل خرطوشة الطباعة المحملة بالحبر الحيوي الخلوي في أداة التوزيع الهوائية المحيطة سعة 3 ملليلتر الخاصة بالطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد القائمة على البثق.
انقر فوق الزر تبريد أسفل علامة التبويب التحكم في التدفئة أو التبريد على شاشة واجهة الطابعة الحيوية لضبط درجة حرارة سرير الطباعة على 4 درجات مئوية. قم بتحميل اللوحة بحمام الدعم الموجود على سرير الطابعة. في علامة التبويب طباعة على شاشة واجهة الطابعة الحيوية ، انقر فوق مهمة الطباعة ، ثم انقر فوق ابدأ ، متبوعا ب GO لبدء مهمة الطباعة.
بعد الطباعة ، قم بتعريض لوحة البئر لمصدر ضوء 405 نانومتر بكثافة 3 مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمدة 30 ثانية لبدء الربط المتقاطع للحبر الحيوي rhCollMA. بعد الربط المتبادل ، احتضن صفيحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل حتى يذوب كل حمام الدعم. استنشق حمام الدعم المسال بلطف واستبدله بوسط الخلايا البطانية.
احتضان التركيبات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مباشرة بعد إزالة مواد الدعم من شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المطبوعة بيولوجيا ، ضع سقالة الأوعية الدموية PLLA:PLGA المغلفة بالفيبرونيكتين بجوار الهيكل المطبوع بيولوجيا. أدخل السقالة الوعائية في القناة الرئيسية للهيكل المطبوع بيولوجيا.
احتضان الهياكل المجمعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين. قم بإعداد تعليق خلوي للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المعبرة عن الطماطم بتركيز 10 ملايين خلية لكل ملليلتر. ضع قطرة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا على سطح مسعور.
ضع السقالات الوعائية بلطف فوق القطرة بحيث يتلامس تجويف السقالة على أحد طرفيها مع قطرة الخلية. استنشاق القطرة من الطرف المقابل للسقالة التي تملأ تجويفها بتعليق الخلية. ضع السقالة الجالسة في أنبوب طرد مركزي صغير وضعها في دوار داخل حاضنة مرطبة لمدة 60 دقيقة.
أخيرا ، انقل السقالة إلى صفيحة من 12 بئرا وأضف 2 ملليلتر من وسط الخلايا البطانية. يظهر هنا المنظر الجانبي لرفرف تمثيلي مصمم هندسيا تم تصويره بعد أربعة أيام من البطانة البطانية للسقالة الوعائية. تظهر الأوعية الدموية الدقيقة المطبوعة بيولوجيا باللون الأخضر ، بينما تظهر البطانة البطانية باللون الأحمر.
تظهر الصورة التمثيلية المفاغرة بين الأوعية الدموية المطبوعة بيولوجيا والبطانة البطانية. يظهر هنا التلطيخ المناعي للأكتين العضلي الأملس والنوى والخلايا البطانية بعد سبعة أيام من الحضانة. تعرض الصورة التمثيلية مفاغرة مكتملة للرفرف الهندسي مع الشريان الفخذي للفئران قبل إزالة المشبك وبعد إزالة المشبك.
يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة نضج وتكامل الأوعية الدموية المطبوعة 3D في الجسم الحي ومراقبة تروية الزرع في الطرف الخلفي لتحديد إمكانات وسلامة استخدامه لعلاج عيوب الأنسجة.
