أي مشروع علم الحياة التي تتطلب 3D فائقة البنية التحقيق من منطقة معينة من الاهتمام في عينة بيولوجية معقدة يمكن الاستفادة من هذه التقنية. إجراء إعداد العينة هو نفسه بالنسبة لاثنين من طرائق التصوير يجري SBF / SEM وFIB-SEM. استخدام الميكروويف يسرع بشكل كبير حتى جزء معالجة العينة.
على الرغم من أن يظهر هنا لنصائح الجذر، يمكن استخدام هذا البروتوكول لأي نظام نموذج بيولوجي مع الحد الأدنى من التعديلات. قبل استخدام هذا العمل لربط SBF / SEM و FIB-SEM ، يجب أن يكون المرء على دراية بالتقنيات الفردية. تنفيذ بعض الخطوات هو واضح بسهولة ولكن من الصعب وصفها في نص مكتوب.
إثبات الإجراء سيكون بيتر بورغراف الذي هو فني في مختبرنا. للبدء، وقطع نصائح الجذر من شتلات ثاليانا arabidopsis الثابتة على لوحات أجار ووضع اثنين إلى ثلاثة نصائح في أنابيب Eppendorf التي تحتوي على نفس مثبت بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في الصباح، مع ماصة، استبدال المثبت مع 0.1 عازلة فوسفات المولر في درجة الH 6.8 في الأنابيب مع الأنابيب على طاولة الدورية في 100 دورة في الدقيقة وغسل لمدة 10 دقيقة.
ثم كرر الغسيل باستخدام الفوسفات العازلة الطازجة خمس مرات. في غطاء الدخان، بعد إصلاح النصائح الجذرية عن طريق استبدال العازلة الفوسفات مع 2٪ أوسميوم تتروكسيد و 0.2٪ روثينيوم الأحمر في 0.1 عازلة فوسفات المولر في 6.8 pH مع أنابيب مع أغطية مفتوحة في الميكروويف وبدء البرنامج. ثم تجاهل الحل في الأنابيب وغسل نصائح الجذر مرتين مع الماء المقطر مزدوجة لمدة خمس دقائق لكل من.
لغسل المياه المقطرة مزدوجة الثالث والرابع، واستخدام الميكروويف للمساعدة في غسل. بعد أول 40 ثانية غسل المياه المقطر مزدوجة، واتخاذ عينات طرف الجذر من الميكروويف واستبدال المياه المقطرة مزدوجة مع المياه المقطرة مزدوجة طازج. ضع العينات مرة أخرى في الميكروويف ومتابعة البرنامج.
المقبل, إعداد حل TCH بإضافة 0.1 غرام من thiocarbohydrazide إلى 10 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة في أنبوب 15 ملليلتر. ضع الأنبوب في فرن واسخني على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة حتى تذوب. ثم قم بتصفية محلول TCH باستخدام فلتر حقنة ميكرومتر 0.22.
استبدال الحل فورا في أنابيب العينة مع TCH تصفية الحل والاستمرار في البروتوكول. الآن غمر العينات في الإيثانول ووضعها في الميكروويف لتجفيفها في خطوات متدرجة من 50٪ 70٪90٪ثم مرتين من 100٪ العلاج الإيثانول. بعد علاج الجفاف أكسيد البروبيلين، إضافة 50٪ الراتنج سبور في الأنابيب لبدء تسلل نصائح الجذر لمدة لا تقل عن ساعتين.
بعد الحضانة النهائية في راتنج سبور 100٪ ، ضع النصائح الجذرية في تضمين القوالب وملء القوالب براتنج 100٪ سبور الطازجة والبليمرة في فرن في 65 درجة مئوية لمدة 36 إلى 48 ساعة. أولاً، استخدم شفرة حلاقة لتقليم العينة المُتَمَّرة تقريبًا إلى كتلة رقيقة. مع الجانب بعد تعرض الأنسجة التي تواجهها إلى أسفل، نعلق العينة إلى مركز دبوس معدني مع راتنج الايبوكسي موصل أن يكون الأنسجة لمس دبوس معدني.
ضع العينة في فرن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لعلاج الايبوكسي بين عشية وضحاها. في الصباح، قم بتحميل الدبوس المعدني في الناقل واستخدم شفرة حلاقة لإزالة أي إيبوكسي الزائدة من العينة. لزيادة سلاسة وجه العينة، قم بتحميل الحامل مع الدبوس المعدني في الحامل للحصول على الـ ultramicrotome.
في ultramicrotome، واستخدام سكين الزجاج أو الماس لتنعيم وجه الجانبين من كتلة تشكيل هرم. تأكد من أن بعض الأنسجة على الأقل قد تعرضت بالفعل على الوجه كتلة. ثم ضع كتلة العينة المشذبة في المعطف المكسو بالقطع وقم بضبط الإعدادات إلى البلاتين في اثنين إلى خمسة نانومترات لمعطف العينة بطبقة رقيقة.
أدخل الحامل في مجهر SBF-SEM. جلب سكين الماس على مقربة من سطح العينة وتقليم قبالة الجزء العلوي من العينة لإزالة طبقة البلاتين وفضح جزء من الأنسجة. ثم تعيين الجهد المتسارع إلى 1.5 إلى 2 كيلوفولت.
التقط صورة للأنسجة وإعداد تشغيل التصوير. باستخدام برنامج فيجي، حدد ملف، استيراد، تسلسل صورة وتحديد موقع كومة الصور لتحميل الصور. بعد ضبط الصورة وفقًا للمخطوطة، تحقق من المحاذاة عن طريق التمرير عبر مجموعة البيانات.
استخدم أمر الحفظ أسفل قائمة الملف لحفظ مجموعة البيانات المحاذية كملف TIFF ثلاثي الأبعاد. قم بتحليل مجموعة البيانات بعناية لمعرفة ما إذا كان عائد الاستثمار متضمناً ويحتوي على المعلومات اللازمة للمسألة البيولوجية. على الصورة الأخيرة من المكدس، وهو الوجه كتلة الحالي في المجهر SBF-SEM، حدد عائد استثمار جديد لـ FIB-SEM.
بعد طلاء مع البلاتين مرة أخرى، تحميل العينة في FIB-SEM واستخدام كاشف الإلكترون الثانوي في 15 كيلوفولت واحد و نانومب لتحديد موقع العائد على الاستثمار التي تم تحديدها في SBF-SEM على وجه كتلة. تحرك وإمالة المرحلة لجلب العائد على الاستثمار على العينة إلى نقطة الصدفة من الحزم FIB و SEM ، وذلك باستخدام شعاع FIB ونظام حقن الغاز. إيداع طبقة حماية واحدة ميكرومتر من البلاتين على السطح فوق العائد على الاستثمار.
المقبل، وذلك باستخدام تيار الطحن منخفضة تتراوح بين 50 و 100 picoamps، وطحن الخطوط الدقيقة في ترسب البلاتين للصورة وتتبع 3D خلال تشغيل التصوير. ثم باستخدام تيار الطحن عالية من 30 نانومبير، طاحونة خندق من 30 ميكرومتر أمام العائد على الاستثمار خلق سطح التصوير لشعاع SEM. بعد تجانس سطح الصورة، ابدأ تشغيل التصوير واراقب استقرار العملية خلال أول 50 إلى 100 مقطع.
بمجرد أن يعمل النظام بسلاسة، اترك الغرفة وتأكد من وجود اضطراب أقل في الغرفة قدر الإمكان. توفر الصور من SBF-SEM نظرة عامة على الأنسجة التي تعطي نظرة ثاقبة على التوجه المكاني للخلايا والاتصالات داخل الخلايا. يضيف التصوير FIB-SEM اللاحق على منطقة جديدة تفاصيل عالية الدقة لخلايا وبنيات محددة.
بيانات SBF-SEM يظهر تقديم مختلفة من voxels غير isotropic من البيانات VOXEL ISOTROPIC FIB-SEM. SBF-SEM يقدم تأثير درج على السطح في حين أن البيانات FIB-SEM وجود الأقسام الخمسة نانومتر يضمن أن التجسيد يبدو أكثر سلاسة والأقسام الفردية مزيج في السطح تماما. يصف هذا البروتوكول تصوير منطقة فريدة في عينة واحدة وأي انحراف عن سير العمل قد يسبب تلفًا للعينة مما يجعل من المستحيل نقل المنطقة ذات الأهمية.
