Jedes Life-Science-Projekt, das eine 3D-Ultrastrukturuntersuchung einer bestimmten Region erfordert, die für eine komplexe biologische Probe von Interesse ist, kann diese Technik nutzen. Das Probenvorbereitungsverfahren ist für zwei bildgebende Verfahren wie SBF/SEM und FIB-SEM identisch. Die Verwendung der Mikrowelle beschleunigt den Probenbearbeitungsteil erheblich.
Obwohl hier für Root-Tipps gezeigt, kann dieses Protokoll für jedes biologische Modellsystem mit minimalen Anpassungen verwendet werden. Bevor man diesen Workflow zur Korrelation von SBF/SEM und FIB-SEM nutzt, sollte man mit den einzelnen Technologien vertraut sein. Die Ausführung bestimmter Schritte ist leicht zu demonstrieren, aber schwer in geschriebenem Text zu beschreiben.
Demonstriert wird das Verfahren von Peter Borghgraef, der Techniker in unserem Labor ist. Zunächst die Wurzelspitzen der fixierten Arabidopsis thaliana Sämlinge auf Agarplatten schneiden und zwei bis drei Spitzen in Eppendorfer Röhren mit dem gleichen Fixativ über Nacht bei vier Grad Celsius setzen. Morgens mit einer Pipette fixativ mit 0,1 Molarphosphatpuffer bei pH 6,8 in den Rohren mit den Rohren auf einem rotierenden Tisch bei 100 U/min ersetzen und 10 Minuten waschen.
Dann die Wäsche mit frischem Phosphatpuffer fünfmal wiederholen. In einer Dunstabzugshaube die Wurzelspitzen nach dem Fixieren nachdem fixieren, indem Sie den Phosphatpuffer durch 2%osmiumtetroxid und 0,2%rutheniumrot in 0,1 Molarphosphatpuffer bei pH 6,8 ersetzen, wobei die Rohre mit Deckeln in einer Mikrowelle geöffnet sind und das Programm starten. Dann die Lösung in den Rohren entsorgen und die Wurzelspitzen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils fünf Minuten waschen.
Für die dritte und vierte doppeldestillierte Wasserwäsche, verwenden Sie die Mikrowelle, um die Wäsche zu unterstützen. Nach den ersten 40 Sekunden doppelt destilliertes Wasser waschen, die Wurzelspitzenproben aus der Mikrowelle nehmen und das doppelt destillierte Wasser durch frisches doppelt destilliertes Wasser ersetzen. Legen Sie die Proben wieder in die Mikrowelle und setzen Sie das Programm fort.
Als nächstes bereiten Sie TCH-Lösung vor, indem Sie 0,1 Gramm Thiocarbohydrazid zu 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser in einem 15 Milliliter-Rohr hinzufügen. Das Rohr in einen Ofen stellen und bei 60 Grad Celsius eine Stunde lang erhitzen, um sich aufzulösen. Filtern Sie dann die TCH-Lösung mit einem 0,22 Mikrometer Spritzenfilter.
Ersetzen Sie die Lösung in den Probenröhrchen sofort durch die gefilterte TCH-Lösung und fahren Sie mit dem Protokoll fort. Tauchen Sie nun die Proben in Ethanol ein und legen Sie sie in die Mikrowelle, um sie in abgestuften Schritten von 50%70%90% und dann zweimal in die Mikrowelle zu dehydrieren. Nach der Behandlung mit Propylenoxid-Dehydrierung 50%Spurr-Harz in die Rohre geben, um für mindestens zwei Stunden mit der Infiltration der Wurzelspitzen zu beginnen.
Nach der letzten Inkubation in 100%Spurr-Harz die Wurzelspitzen in einbettende Formen legen und die Formen mit frischem 100%Spurr-Harz füllen und 36 bis 48 Stunden in einem Ofen bei 65 Grad Celsius polymerisieren. Verwenden Sie zunächst eine Rasierklinge, um die polymerisierte Probe grob in einen dünnen Block zu trimmen. Wenn die Seite mit nach unten gerichtetem Gewebe ist, befestigen Sie die Probe an der Mitte eines Metallstifts mit leitfähigem Epoxidharz, um das Gewebe den Metallstift berühren zu lassen.
Die Probe bei 65 Grad Celsius in einen Ofen stellen, um das Epoxid über Nacht auszuhärten. Laden Sie am Morgen den Metallstift in den Träger und verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges Epoxid aus der Probe zu entfernen. Um die Oberfläche der Probe weiter zu glätten, laden Sie den Träger mit dem Metallstift im Halter für das Ultramikrotom.
Verwenden Sie im Ultramikrotom ein Glas- oder Diamantmesser, um die Seite der Seiten des Blocks zu glätten, der eine Pyramide bildet. Stellen Sie sicher, dass zumindest ein Teil des Gewebes bereits auf der Blockfläche freigelegt ist. Legen Sie dann den getrimmten Probenblock in den Sputorsenlacker und passen Sie die Einstellungen auf Platin auf zwei bis fünf Nanometer an, um die Probe mit einer dünnen Schicht zu beschichten.
Setzen Sie den Träger in das SBF-SEM-Mikroskop ein. Bringen Sie das Diamantmesser in die Nähe der Probenoberfläche und schneiden Sie den oberen Teil der Probe ab, um die Platinschicht zu entfernen und einen Teil des Gewebes freizulegen. Stellen Sie dann die Beschleunigungsspannung auf 1,5 bis 2 Kilovolt ein.
Erfassen Sie ein Bild des Gewebes und richten Sie einen Bildlauf ein. Mit Fidschi-Software, wählen Sie Datei, Import, Bildsequenz und suchen Sie den Bild-Stack, um die Bilder zu laden. Nachdem Sie das Bild an das Manuskript angepasst haben, überprüfen Sie die Ausrichtung, indem Sie durch den Datensatz scrollen.
Verwenden Sie den Befehl speichern im Dateimenü, um den ausgerichteten Datensatz als 3D-TIFF-Datei zu speichern. Analysieren Sie den Datensatz sorgfältig, um festzustellen, ob der ROI enthalten ist, und enthalten Sie die Informationen, die für die biologische Frage erforderlich sind. Wählen Sie auf dem letzten Bild des Stacks, der aktuellen Blockfläche im SBF-SEM-Mikroskop, einen neuen ROI für FIB-SEM.
Nach der erneuten Beschichtung mit Platin laden Sie die Probe in das FIB-SEM und verwenden Sie den Sekundärelektronendetektor mit 15 Kilovolt und einen Nanoamp, um den im SBF-SEM identifizierten ROI auf der Blockfläche zu lokalisieren. Bewegen und kippen Sie die Bühne, um den ROI auf der Probe in den Koinzidenzpunkt der FIB- und SEM-Strahlen zu bringen, indem Sie das FIB-Strahl- und Gaseinspritzsystem verwenden. Legen Sie eine ein Mikrometer Schützenschicht aus Platin auf der Oberfläche über dem ROI ab.
Als nächstes fräsen Sie mit einem niedrigen Frässtrom von 50 bis 100 Picoamps feine Linien in die Platinabscheidung für die Autofokussierung und 3D-Tracking während des Bildgebungslaufs. Dann fräsen Sie mit einem hohen Frässtrom von 30 Nanoamps einen Graben von 30 Mikrometern vor dem ROI und schaffen so die Bildfläche für den SEM-Strahl. Nach dem Glätten der Bildoberfläche starten Sie den Bildlauf und überwachen Sie die Stabilität des Prozesses während der ersten 50 bis 100 Abschnitte.
Sobald das System reibungslos läuft, verlassen Sie den Raum und stellen Sie sicher, dass es so wenig Störungen wie möglich im Raum gibt. Bilder aus dem SBF-SEM geben einen Überblick über das Gewebe und geben Einblicke in die räumliche Ausrichtung von Zellen und intrazellulären Verbindungen. Die nachfolgende FIB-SEM-Bildgebung in einer neuen Region fügt hochauflösende Details bestimmter Zellen und Strukturen hinzu.
SBF-SEM-Daten zeigen eine unterschiedliche Wiedergabe der nicht-isotropen Voxel aus den isotropen VOXel-FIB-SEM-Daten. SBF-SEM zeigt einen Treppeneffekt auf der Oberfläche, während die FIB-SEM-Daten mit den fünf Nanometer-Abschnitten dafür sorgen, dass das Rendering viel glatter erscheint und einzelne Abschnitte vollständig in die Oberfläche einfließen. Dieses Protokoll beschreibt die Abbildung einer eindeutigen Region in einer einzigen Probe, und jede Abweichung vom Workflow kann zu Schäden an der Probe führen, sodass eine Verlagerung des Interessenbereichs nicht möglich ist.
