Karmaşık bir biyolojik örnekle ilgili belirli bir bölgenin 3Boyutlu ultrayapı araştırması gerektiren herhangi bir yaşam bilimi projesi bu tekniği kullanabilir. Örnek hazırlama prosedürü, SBF/SEM ve FIB-SEM olmak sebeb olmak ta olan iki görüntüleme yöntemi için aynıdır. Mikrodalgafırının kullanımı numune işleme kısmını önemli ölçüde hızlandırıyor.
Kök ipuçları için burada gösterilmiş olsa da, bu protokol en az ayarlamaları ile herhangi bir biyolojik model sistemi için kullanılabilir. SBF/SEM ve FIB-SEM ile ilişkilendirme için bu iş akışını kullanmadan önce, tek tek teknolojilere aşina olmak gerekir. Belirli adımların yürütülmesi kolayca gösterilebiyi ancak yazılı metinde açıklamak zordur.
Prosedürü gösteren peter Borghgraef bizim laboratuvarda bir teknisyen olacaktır. Başlamak için, agar plakaları üzerinde sabit Arabidopsis thaliana fidekök uçları kesmek ve eppendorf tüpleri dört derece santigrat aynı fiksatif içeren iki ila üç ipucu koymak. Sabahları, bir pipet ile, 100 RPM dönen bir masada tüpler ile tüpler pH 6.8 0.1 molar fosfat tampon ile fiksatif değiştirin ve 10 dakika yıkayın.
Daha sonra taze fosfat tamponu kullanarak yıkamayı beş kez tekrarlayın. Bir duman kaputunda, fosfat tamponunu %2 osmiyum tetroksit ve 0,1 molar fosfat tamponunda 0,1 molar fosfat tamponu ile değiştirerek kök uçlarını düzeltin ve kapakları mikrodalgada açık tüpler le programı başlatın. Daha sonra çözeltiyi tüplere atın ve kök uçlarını her biri beş dakika boyunca çift distile suyla iki kez yıkayın.
Üçüncü ve dördüncü çift distile su yıkama için, yıkama yardımcı olmak için mikrodalga kullanın. İlk 40 saniyeçift distile su yıkama sonra, mikrodalga kök ucu örnekleri almak ve taze çift distile su ile çift distile su değiştirin. Örnekleri mikrodalgaya geri koy ve programa devam et.
Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre çift distile suya 0,1 gram tiyokarbohidaz ekleyerek TCH çözeltisini hazırlayın. Bir fırında tüp yerleştirin ve erimesi için bir saat için 60 santigrat derece ısı. Ardından TCH çözeltisini 0,22 mikrometre şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
Numune tüplerinde bulunan çözeltiyi filtrelenmiş TCH çözeltisi ile hemen değiştirin ve protokolle devam edin. Şimdi etanol örnekleri batırın ve% 50% 70% 90 dereceli adımlarve daha sonra iki kez% 100 etanol tedavi dereceli adımlarda dehydrate mikrodalga içine yerleştirin. Propilen oksit dehidratasyon tedavisinden sonra, en az iki saat boyunca kök uçları infiltrasyon başlatmak için tüpler içine% 50 Spurr rezorin ekleyin.
% 100 Spurr's reçine son kuluçka sonra, kalıpgömme kök ipuçları yerleştirin ve taze ile kalıpları doldurun 100% Spurr's reçine ve 36 ila 48 saat boyunca 65 santigrat derece santigrat bir fırında polimerize. İlk olarak, polimerize numuneyi kabaca ince bir blok halinde kesmek için bir jilet kullanın. Yan aşağı bakacak şekilde maruz kalan doku ile, iletken epoksi reçine ile metal bir pin merkezine doku metal pin dokunmadan için örnek takın.
Bir gecede epoksi tedavi etmek için 65 santigrat derece bir fırında örnek yerleştirin. Sabahları, metal pimi taşıyıcıya yükleyin ve numunedeki fazla epoksiyi çıkarmak için jilet kullanın. Numunenin çehresini daha da düzebilmek için taşıyıcıyı ultramikrotom için tutucudaki metal pimle yükleyin.
Ultramicrotome olarak, bir piramit oluşturan bloğun kenarlarının yüzünü pürüzsüz bir cam veya elmas bıçak kullanın. En azından bazı doku zaten blok yüzünde maruz olduğundan emin olun. Daha sonra kesilmiş numune bloğunu püskürtücü kaplamaya yerleştirin ve ince bir tabaka ile numuneyi kaplamak için ayarları 2-5 nanometrede platin olarak ayarlayın.
Taşıyıcıyı SBF-SEM mikroskobuna takın. Elmas bıçağı numune yüzeyine yaklaştırın ve platin tabakasını çıkarmak ve dokunun bir kısmını ortaya çıkarmak için numunenin üst kısmını kırpın. Daha sonra hızlanma gerilimini 1,5 ila 2 kilovolta ayarlayın.
Dokunun görüntüsünü yakalayın ve bir görüntüleme çalışması ayarlayın. Fiji yazılımını kullanarak, dosyayı seçin, içe aktarın, görüntü dizisini seçin ve görüntüleri yüklemek için görüntü yığınını bulun. Görüntüyü makaleye göre ayarladıktan sonra, veri setinde kaydırarak hizalamayı kontrol edin.
Hizalanmış veri kümesini 3B TIFF dosyası olarak kaydetmek için dosya menüsünün altındaki kaydet komutunu kullanın. YG'nin dahil olup olmadığını ve biyolojik soru için gerekli bilgileri içerip içermediğini görmek için veri kümesini dikkatle analiz edin. SBF-SEM mikroskobundaki geçerli blok yüzü olan yığının son görüntüsünde FIB-SEM için yeni bir ygiçin yeni bir yg.
Tekrar platinle kaplandıktan sonra, numuneyi FIB-SEM'e yükleyin ve blok yüzündeki SBF-SEM'de tanımlanan Yatırım Getirisi'ni bulmak için 15 kilovolt ve bir nanoamp taki ikincil elektron dedektörünü kullanın. FIB ışını ve gaz enjeksiyon sistemini kullanarak numuneüzerindeki Yatırım Getirisi'i FIB ve SEM ışınlarının tesadüf noktasına getirmek için sahneyi hareket ettirin ve yatırın. Yatırım getirisiüzerinde yüzeye bir mikrometre koruyucu platin tabakası koyun.
Daha sonra, 50 ila 100 pikoamp arasında değişen düşük frezeleme akımı kullanarak, görüntüleme çalışması sırasında otofokus ve 3D izleme için platin birikimi içine değirmen ince çizgiler. Daha sonra 30 nanoamp'lık yüksek frezeleme akımı nı kullanarak, Yatırım Getirisi'nin önünde 30 mikrometrelik bir açma ve SEM ışını için görüntüleme yüzeyini oluşturarak. Görüntü yüzeyini düzleştirdikten sonra görüntüleme işlemini başlatın ve ilk 50 ila 100 bölüm boyunca işlemin kararlılığını izleyin.
Sistem sorunsuz bir şekilde çalışmaya başladığında, odadan ayrılın ve odada mümkün olduğunca az rahatsızlık olduğundan emin olun. SBF-SEM'den alınan görüntüler, hücrelerin ve hücre içi bağlantıların uzamsal yönelimi hakkında bilgi veren dokuya genel bir bakış sağlar. Yeni bir bölgede sonraki FIB-SEM görüntüleme belirli hücre ve yapıların yüksek çözünürlüklü ayrıntı ekler.
SBF-SEM verileri, izotropik olmayan voksellerin izotropik voksel FIB-SEM verilerinden farklı bir şekilde görüntülenerek görüntülenerek ortaya çıkar. SBF-SEM yüzeyde bir merdiven etkisi sunarken, beş nanometre kesitine sahip FIB-SEM verileri, işlemenin çok daha düzgün görünmesini ve tek tek bölümlerin yüzeye tamamen karışmasını sağlar. Bu protokol, tek bir örnekte benzersiz bir bölgenin görüntülenmesi açıklanır ve iş akışından herhangi bir sapma, ilgi alanının taşınmasını imkansız hale getirerek numuneye zarar verebilir.
