Любой проект по науке о жизни, который требует 3D ультраструктурного исследования конкретного региона, заинтересованного в сложном биологическом образце, может использовать этот метод. Процедура подготовки образца одинакова для двух условий визуализации: SBF/SEM и FIB-SEM. Использование микроволновой печи существенно ускоряет обработку образца.
Хотя показано здесь для корневых советов, этот протокол может быть использован для любой биологической модели системы с минимальными корректировками. Прежде чем использовать этот рабочий процесс для сопоставления SBF/SEM и FIB-SEM, следует ознакомиться с отдельными технологиями. Выполнение определенных шагов легко продемонстрировано, но трудно описать в письменном тексте.
Демонстрация процедуры будет Питер Borghgraef, который является техником в нашей лаборатории. Для начала вырежьте корневые кончики фиксированных саженцев арабидопсиса талиана на агарных пластинах и положите два-три наконечника в трубы Эппендорфа, содержащие тот же фиксатор на ночь при четырех градусах по Цельсию. Утром, с пипеткой, заменить фиксатор с 0,1 молярного фосфатного буфера при рН 6,8 в трубах с трубками на вращающемся столе при 100 об/мин и мыть в течение 10 минут.
Затем повторите стирку с помощью свежего фосфатного буфера пять раз. В дымовой капот, после исправления корневых кончиков, заменив фосфат буфера с 2%osmium тетроксид и 0,2%рутения красный в 0,1 молярного фосфатного буфера на рН 6,8 с трубами с крышками открыты в микроволновой печи и начать программу. Затем отбросьте раствор в трубках и мыть кончики корней дважды с двойной дистиллированной водой в течение пяти минут каждый.
Для третьего и четвертого двойной дистиллированной воды мыть, использовать микроволновую печь, чтобы помочь мыть. После первых 40 секунд двойной дистиллированной воды мыть, взять образцы корневой наконечник из микроволновой печи и заменить двойной дистиллированной воды со свежей двойной дистиллированной воды. Положите образцы обратно в микроволновую печь и продолжить программу.
Затем приготовьте раствор TCH, добавив 0,1 грамма тиокарбидразида в 10 миллилитров двойной дистиллированной воды в 15 миллилитровую трубку. Поместите трубку в духовку и нагревать при температуре 60 градусов по Цельсию в течение одного часа, чтобы раствориться. Затем отфильтруйте раствор TCH с помощью фильтра шприца 0,22 микрометра.
Немедленно замените раствор в пробных трубках на отфильтрованный раствор TCH и продолжайте с протоколом. Теперь погрузите образцы в этанол и поместите их в микроволновую печь, чтобы обезвоживать в градуированных шагов 50%70%90%, а затем в два раза 100% этанола лечения. После лечения обезвоживания оксида пропилена, добавить 50% смолы Spurr в трубы, чтобы начать проникновение корневых кончиков в течение как минимум двух часов.
После окончательной инкубации в 100%Spurr в смолы, место корневые кончики в встраивании формы и заполнить формы со свежей 100%Spurr смолы и полимеризации в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 36 до 48 часов. Во-первых, используйте лезвие бритвы, чтобы примерно обрезать полимеризованный образец в тонкий блок. С стороны, подвергаясь ткани лицом вниз, приложите образец к центру металлической булавки с проводящим эпоксидной смолы, чтобы ткань касаясь металлической булавки.
Поместите образец в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы вылечить эпоксидную смолу на ночь. Утром загрузите металлический штифт в носитель и используйте лезвие бритвы, чтобы удалить излишки эпоксидной смолы из образца. Чтобы еще больше сгладить лицо образца, загрузите носитель металлической булавкой в держатель для ультрамикротома.
В ультрамикротоме используйте стеклянный или алмазный нож, чтобы сгладить лицо сторон блока, образующего пирамиду. Убедитесь, что по крайней мере некоторые ткани уже выставлены на лицо блока. Затем поместите обрезанный блок образца в распылитель и отрегулируйте настройки до платины на два-пять нанометров, чтобы покрыть образец тонким слоем.
Вставьте носитель в микроскоп SBF-SEM. Принесите алмазный нож близко к поверхности образца и обрезать верхнюю часть образца, чтобы удалить слой платины и подвергать часть ткани. Затем установите ускоряющееся напряжение до 1,5-2 киловольт.
Захват изображения ткани и настроить изображение перспективе. Используя программное обеспечение Фиджи, выберите файл, импорт, последовательность изображений и найдите стек изображений для загрузки изображений. После настройки изображения в соответствии с рукописью проверьте выравнивание, прокрутите набор данных.
Используйте команду сохранения в меню файлов для сохранения выровненного набора данных в качестве файла 3D TIFF. Тщательно проанализируйте набор данных, чтобы узнать, включена ли рентабельность инвестиций, и содержит информацию, необходимую для биологического вопроса. На последнем изображении стека, который является текущим лицом блока в микроскопе SBF-SEM, выберите новую рентабельность инвестиций для FIB-SEM.
После покрытия платиной снова загрузите образец в FIB-SEM и используйте вторичный детектор электронов на 15 киловольт и один наноампер, чтобы найти roi, идентифицированный в SBF-SEM на блочных лицах. Перемещение и наклон этапе довести рентабельность инвестиций на образец в точку совпадения FIB и SEM лучей, используя FIB пучка и системы закачки газа. Депозит один микрометровый защитный слой платины на поверхности над рентабельностью инвестиций.
Далее, используя низкий ток фрезерования в диапазоне от 50 до 100 пикоампер, мельница тонких линий в платиновом осаждении для автофокусирования и 3D слежения во время запуска изображений. Затем с помощью высокого фрезерного тока 30 наноампер, мельница траншеи 30 микрометров перед рентабельностью инвестиций создания поверхности изображения для луча SEM. После сглаживания поверхности изображения начните запуск изображения и следите за стабильностью процесса в течение первых 50-100 секций.
Как только система работает гладко, выйти из комнаты и убедитесь, что есть как мало нарушений в комнате, как это возможно. Изображения из SBF-SEM обеспечивают обзор ткани, дая представление о пространственной ориентации клеток и внутриклеточных связей. Последующая визуализация FIB-SEM в новом регионе добавляет детали с высоким разрешением конкретных ячеек и структур.
Данные SBF-SEM показывают различную визуализацию неизотропных вокселов из данных изотропного воксела FIB-SEM. SBF-SEM представляет эффект лестницы на поверхности, в то время как данные FIB-SEM, имеющие пять секций нанометров, гарантируют, что рендеринг выглядит намного более гладкой, а отдельные секции полностью сливаются с поверхностью. Этот протокол описывает изображение уникального региона в одном образце, и любое отклонение от рабочего процесса может привести к повреждению выборки, что делает невозможным перемещение области интересов.
