الغرض من هذه المقالة هو توفير بروتوكول بصري مفصل، متدرج لاستخراج الأيضات مائي من الخلايا السرطانية المستزرعة لتحليل المستقلب اللاحقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها وموثوقيتها لاستخراج الأيضات من الخلايا الملتنقة. ولكن قبل كل شيء، انها الأمثل جيدا لتحليل المستقلب باستخدام الشعيرات الدموية الكهربائي الكتلة الطيفية أو CEMS.
الاستقلاب هو تقنية قوية لتحديد المؤشرات الحيوية أو الكشف عن سرطان المرحلة المبكرة والتنبؤ باستجابة العلاج الكيميائي لمرضى السرطان. نستخدم الخلايا السرطانية في هذه المظاهرة. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لحصاد الأيض من الخلايا الأخرى المنضمة مثل الخلايا الليفية في خلايا iPS.
يتم تطبيع تركيزات المستقلب على أساس عدد الخلايا القابلة للحياة. لذا إعداد دقيق للثقافة، وهذا هو المفتاح للحصول على بيانات جيدة reproducible. إثبات الإجراء سيكون (آمي ماروياما) فني من مختبري
للبدء، لوحة HCC827 وPC-9 الخلايا في 100 ملليمتر أطباق تحتوي على 10 ملليلتر من 1640-1640 1640 متوسطة مكملة مع مصل الأبقار الجنين 10٪. ضع الأطباق في حاضنة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون و37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى الثقافة. بعد الحضانة، إمالة بلطف أطباق ثقافة 100 ملليمتر لpirate وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
غسل الخلايا على كل طبق باستخدام مليلتر اثنين من محلول ملحي الفوسفات المخزنة دون الكالسيوم والمغنيسيوم. صخرة بلطف كل طبق بحيث يغطي حل برنامج تلفزيوني تماما سطح الطبق، ثم إمالة الأطباق لpirate المخزن المؤقت للغسيل. دافئ 0.25٪ تريبسين-EDTA حل إلى 37 درجة مئوية.
مع ماصة مصلية من خمسة ملليلتر، أضف ميليتين من محلول التربسين-EDTA الدافئ لكل طبق. صخرة بلطف كل طبق بحيث التربسين يغطي تماما سطح الطبق. احتضان الأطباق الثقافية في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا.
ثم، إضافة أربعة ملليلتر من متوسط النمو الكامل قبل الدافئة إلى كل طبق. ولطفا ماصة عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا في المتوسط. نقل كل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر منفصلة.
أجهزة الطرد المركزي في 800 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في مليلتر اثنين من متوسط النمو الكامل قبل warmed. مزيج 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من 0.4٪ trypan حل الأزرق، في 1.5 ملليلتر microtube.
تحميل 10 ميكرولترات من الخليط في خلية عد شريحة غرفة من خلال عمل الشعرية. أدخل الشريحة في الغرفة في عداد الخلايا المؤتمتة واضغط على زر الالتقاط لالتقاط الصورة وعرض نتائج العدد الإجمالي و قابلية البقاء في الخلايا. إذا كان إجمالي عدد الخلايا فوق 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر، أضف المزيد من متوسط النمو إلى أنبوب المخروطية 15 ملليلتر للحصول على تركيز الخلية المطلوب.
الآن، إضافة 2-5 ملليلتر من الثقافة لكل طبق ثقافة خلية 100 ملليمتر لبذر ما يقرب من واحد إلى 2 1/2 مليون خلية في الطبق الواحد. احتضان الأطباق الثقافة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. أولاً، في قارورة حجمية 15 ملليلتر، تمييع محلول داخلي تجاري قياسي يحتوي على كبريون L-Methionine وحمض D-Camphor-10-sulfonic 1، 000 أضعاف في الماء فائق السخاء.
تذوب مانيتول في المياه فائقة الpure لإعداد 0.05 غرام لكل ميل مانيتول المليلتر في المياه فائقة الpure كما غسل العازلة. ثم، في كوب تصفية كل وحدة تصفية الطرد المركزي، ماصة 250 ميكرولترات من المياه فائقة الpure. قم بتكهّل وحدات التصفية بإحكام، والطرد المركزي عند 9، 100 مرة بـ 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
تحقق من حجم كل من الترشيحات. إذا تراكمت الترشيحات الكبيرة خلال الدوران القصير الأول، فقد تكون وحدة التصفية معيبة. تجاهل وحدة التصفية واستخدم وحدة تصفية جديدة بدلاً من ذلك.
أغلق أغطية وحدات التصفية بإحكام والطرد المركزي مرة أخرى عند 9، 100 مرة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد من عدم وجود ماء فائق الخطورة في أي من أكواب التصفية، وإزالة المياه فائقة الخطورة المصفاة في كل أنبوب جمع مع ماصة. ضع أكواب الفلتر مرة أخرى في أنابيب جمعها، واستخدم وحدات تصفية الطرد المركزي في غضون ساعة لتجنب التلف عند التجفيف.
أخرج أطباق الثقافة 100 ملليمتر من الحاضنة وpirate متوسطة ثقافة الخلية من كل طبق. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ثقافة المتوسطة مع أو بدون 250 diamide ميكرومولار إلى كل طبق، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. احتضان الأطباق الثقافية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة، التعرق متوسطة ثقافة الخلية من كل طبق ثقافة 100 ملليمتر. إمالة قليلا الطبق، وإضافة بلطف مليلترين من 5٪ مانيتول غسل العازلة إلى حافة كل طبق لغسل الخلايا، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. استلهمي المخزن المؤقت للغسيل من كل طبق ثقافة، وغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إمالة الطبق قليلاً وإضافة 10 ملليلترات بلطف من عازلة الغسيل لكل طبق.
ثم، pirate تماما العازلة غسل من حافة كل طبق الثقافة. الآن، إضافة 800 ميكرولترات من 99.7٪ الميثانول لكل طبق الثقافة، وروك بلطف كل طبق الثقافة ذهابا وإيابا، لتغطية سطحها بأكمله. اترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
إضافة ببطء 550 ميكرولترات من محلول القياسية الداخلية المخففة لكل طبق عن طريق غمر غيض من ماصة في الميثانول وpiing بلطف صعودا وهبوطا، عدة مرات. صخرة بلطف كل طبق الثقافة ذهابا وإيابا لتغطية سطحها بأكمله، وترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. ثم، نقل الحل المستخرج من كل طبق الثقافة إلى أنبوب منفصل 1.5 ملليلتر microcentuge.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 2، 300 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. نقل 700 ميكرولترات من كل سوبرنات إلى وحدتين فلتر الطرد المركزي، مع 350 ميكرولترتر لكل وحدة. أجهزة الطرد المركزي أنابيب التصفية في 9، 100 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين تقريبا، حتى لا يبقى سائل في أكواب التصفية.
قم بإزالة أكواب التصفية، واغلق أغطية أنابيب التجميع بإحكام. في هذه الدراسة، نمت خلايا HCC827 وPC-9 بالتساوي لمدة ثلاث ساعات. ويشير تحليل CEMS إلى الفرق بين الخلايا المعالجة بالدايميد والخلايا المعالجة PBS لكلا الخطين.
من بين هذه, العديد من وسيطة في مسار الفوسفات pentose وفي تحلل العليا كانت أعلى بكثير في الشروط المعالجة بالدياميد, في حين أن عدد قليل من الوسطاء دورة ثلاثية الكاربوكسيلية كانت أقل في الحالات المعالجة. وكشفت ملامح المستقلب من الأيض داخل الخلايا 175 و 150 الأيض التفاضلي في HCC827 و PC-9 الخلايا, على التوالي. بعد العلاج بالديراميد، زاد مستوى حمض الغلوكونيك والجلوكوز المؤكد 12 مرة في خلايا HCC827 و10 أضعاف في خلايا PC-9.
وبالمثل، فإن مستوى الجلوكوز 6-الفوسفات، وهو الجلوكوز الفوسفوري في أول تحلل الهكيكوينز-محفز المنتج، كما زاد 6.3-و 3.5 أضعاف في HCC827 و PC-9 الخلايا، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات 6-phosphogluconate، وهو أول وسيط في مسار الفوسفات pentose، زادت بشكل كبير 89 أضعاف في الخلايا HCC827 و 231-fold في خلايا PC-9. في المقابل، لم تتغير مستويات الوسيطة الجليكولية الأخرى مثل الفركتوز 6-فوسفات في حالة الدياميد التجريبية.
مجموع النيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد مستويات الفوسفات كانت تعادل تقريبا بين العلاج دياميد وشروط التحكم PBS. باستخدام 5٪ حل المانينتول، بخلاف برنامج تلفزيوني، كما غسل العازلة لغسل الخلايا مهم جدا لتحليل CEMS، لأن العازلة القائمة على الملح تتداخل مع التحليل وتؤثر سلبا على القياس. هذا البروتوكول غير مناسب لاستخراج المستقلبات الدابيبية مثل الدهون ، لذلك نحن بحاجة إلى تطوير بروتوكول لاستخراج كل من المستقلبات المائية والميتفوبية لتحليل مستقلب أكثر شمولا.
هذه التقنية يدرك سهولة استخراج الأيض من الخلايا المنضمة تقريبا أي, وبالتالي, ينطبق لمجموعة متنوعة من البحوث مثل السرطان, الخلايا الجذعية, علم الصيدلة, التغذية, وعلم التجميل.
