Lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo visivo dettagliato e graduale per l'estrazione di metaboliti acquosi da cellule tumorali coltivate per successive analisi del metaboloma. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità e affidabilità per l'estrazione di metaboliti dalle cellule aderenti. Ma soprattutto, è ben ottimizzato per l'analisi del metaboloma utilizzando l'elettroforesi capillare-spettrometria di massa o CEMS.
La metabolomica è una tecnica potente per identificare i biomarcatori o rilevare il cancro in fase iniziale e prevedere la risposta chemioterapica ai pazienti oncologici. Usiamo cellule tumorali in questa dimostrazione. Tuttavia, questa tecnica può anche essere applicata ai metaboliti del raccolto da altre cellule aderenti come i fibroblasti nelle cellule iPS.
Le concentrazioni di metaboliti sono normalizzate in base al numero di cellule vitali. Quindi un'attenta preparazione della cultura, questa è la chiave per ottenere buoni dati riproducibili. A dimostrare la procedura sarà Ami Maruyama, un tecnico del mio laboratorio.
Per cominciare, piastra HCC827 e CELLE PC-9 in piatti da 100 millimetri contenenti 10 millilitri di mezzo RPMI-1640 integrati con siero bovino fetale al 10%. Mettere i piatti in un'incubatrice al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore alla coltura. Dopo l'incubazione, inclinare delicatamente i piatti di coltura da 100 millimetri per aspirare il supporto di coltura cellulare.
Lavare le cellule su ogni piatto utilizzando due millilitri di soluzione salina tamponata da fosfati senza calcio e magnesio. Scuotere delicatamente ogni piatto in modo che la soluzione PBS copra completamente la superficie del piatto, quindi inclinare i piatti per aspirare il tampone di lavaggio. Soluzione calda 0.25%trypsin-EDTA a 37 gradi Celsius.
Con una pipetta sierologica da cinque millilitri, aggiungere due millilitri della soluzione di tripside-EDTA riscaldata ad ogni piatto. Scuotere delicatamente ogni piatto in modo che la triptina copra completamente la superficie del piatto. Incubare i piatti di coltura a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti.
Quindi, aggiungere quattro millilitri del mezzo di crescita completo pre-riscaldato ad ogni piatto. E pipettare delicatamente più volte per sospendere di nuovo le cellule in mezzo. Trasferire ogni sospensione cellulare in un tubo conico separato da 15 millilitri.
Centrifuga a 800 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo ogni pellet cellulare in due millilitri del mezzo di crescita completo prerifatti. Mescolare 10 microlitri della sospensione cellulare con 10 microlitri di soluzione blu 0,4% trypan, in un microtubo da 1,5 millilitri.
Caricare 10 microlitri della miscela in una camera di conteggio cellulare scorrere attraverso l'azione capillare. Inserire la diapositiva della camera nel contatore di celle automatico e premere il pulsante di acquisizione per acquisire l'immagine e visualizzare i risultati del numero totale e della percentuale di vitalità delle celle. Se il numero totale di cellule è superiore a 0,5 milioni di cellule per millilitro, aggiungere ulteriore mezzo di crescita al tubo conico da 15 millilitri per ottenere la concentrazione cellulare desiderata.
Ora, aggiungete da due a cinque millilitri della coltura a ogni piatto di coltura cellulare da 100 millimetri per seminare circa uno o 2 1/2 milioni di cellule per piatto. Incubare i piatti di coltura in anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 18 ore. In primo luogo, in un matraccio volumetrico da 15 millilitri, diluire una soluzione standard interna commerciale contenente L-metonina sulfone e acido solfonico D-Canfora-10 1.000 volte in acqua ultrapura.
Sciogliere il mannitolo in acqua ultrapura per preparare una soluzione di mannitolo da 0,05 grammi per millilitro in acqua ultrapura come tampone di lavaggio. Quindi, nella tazza filtrante di ogni unità filtrante centrifuga, pipetta 250 microlitri di acqua ultrapura. Limitare saldamente le unità filtranti e centrifugare a 9,100 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Controllare il volume di ogni filtrato. Se durante il primo breve giro si è accumulato un filtrato significativo, l'unità filtrante potrebbe essere difettosa. Scartare l'unità filtro e utilizzare invece una nuova unità filtro.
Chiudere saldamente i coperchi delle unità filtranti e centrifugare nuovamente a 9, 100 volte g a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Assicurarsi che non rimanga acqua ultrapura in nessuna delle tazze filtranti e rimuovere l'acqua ultrapura filtrata in ogni tubo di raccolta con una pipetta. Riposizionare le tazze filtranti nei loro tubi di raccolta e utilizzare le unità filtranti centrifughe entro un'ora per evitare danni all'essiccazione.
Eseni i piatti di coltura da 100 millimetri dall'incubatore e aspira il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura PBS con o senza diammide micromolare 250 ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Incubare i piatti di coltura a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto di coltura di 100 millimetri. Inclinare leggermente il piatto e aggiungere delicatamente due millilitri di tampone di lavaggio del 5% di mannitolo sul bordo di ogni piatto per lavare le cellule, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Aspirare il tampone di lavaggio da ogni piatto di coltura e lavare nuovamente le cellule inclinando leggermente il piatto e aggiungendo delicatamente 10 millilitri di tampone di lavaggio per piatto.
Quindi, aspirare completamente il tampone di lavaggio dal bordo di ogni piatto di coltura. Ora, aggiungi 800 microlitri di 99,7% di metanolo per piatto di coltura e dondola delicatamente ogni piatto di coltura avanti e indietro, per coprire l'intera superficie. Lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 secondi.
Aggiungere lentamente 550 microlitri della soluzione standard interna diluita per piatto immergendo la punta della pipetta nel metanolo e tubazione delicatamente su e giù, più volte. Scuotere delicatamente ogni piatto di coltura avanti e indietro per coprire tutta la sua superficie e lasciare i piatti a temperatura ambiente per 30 secondi. Quindi, trasferire la soluzione estratta da ogni piatto di coltura in un tubo di microcentrifugo separato da 1,5 millilitri.
Centrifugare i tubi a 2.300 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire 700 microlitri di ogni supernatante in due unità filtranti centrifughe, con 350 microlitri per unità. Centrifugare i tubi filtranti a 9,100 volte g a quattro gradi Celsius per circa due ore, fino a quando non rimane liquido nelle tazze filtranti.
Rimuovere le tazze filtranti e chiudere saldamente i coperchi dei tubi di raccolta. In questo studio, le cellule HCC827 e PC-9 sono cresciute allo stesso modo per tre ore. L'analisi CEMS indica la differenza tra le cellule trattate con diammide e le cellule trattate con PBS per entrambe le linee cellulari.
Tra questi, diversi intermedi nella via del fosfato pentoso e nella glicolisi superiore erano significativamente più alti nelle condizioni trattate con diammide, mentre alcuni intermedi del ciclo tricarrbossilico erano più bassi nelle condizioni trattate. I profili metaboloma dei metaboliti intracellulari hanno rivelato 175 e 150 metaboliti differenziali rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. Dopo il trattamento con diammide, il livello di acido gluconico e glucosio ossidato è aumentato di 12 volte nelle cellule HCC827 e di 10 volte nelle cellule PC-9.
Allo stesso modo, il livello di glucosio 6-fosfato, un glucosio fosforilato nel primo prodotto di glicolisi catalizzato da esochinasi, è aumentato anche di 6,3 e 3,5 volte rispettivamente nelle cellule HCC827 e PC-9. Inoltre, i livelli di 6-fosfogluconato, il primo intermedio nella via del fosfato pentoso, sono aumentati drasticamente di 89 volte nelle cellule HCC827 e di 231 volte nelle cellule PC-9. Al contrario, i livelli di altri intermedi glicolitici come il fruttosio 6-fosfato non sono cambiato nella condizione sperimentale della diammide.
I livelli totali di nicotinammide adenina dinucleotide fosfato erano quasi equivalenti tra il trattamento con diammide e le condizioni di controllo pbs. L'utilizzo di una soluzione di mannitolo al 5%, diversa dal PBS, come tampone di lavaggio per le celle di lavaggio è molto importante per l'analisi CEMS, perché i tamponi a base di sale interferiscono con l'analisi e influenzano negativamente la misurazione. Questo protocollo non è adatto per l'estrazione di metaboliti idrofobici come i lipidi, quindi dobbiamo sviluppare un protocollo per estrarre comodamente metaboliti idrofili e idrofobici per un'analisi più completa del metaboloma.
Questa tecnica realizza una facile estrazione di metaboliti da quasi tutte le cellule aderenti e, quindi, è applicabile per una varietà di ricerche come cancro, cellule staminali, farmacologia, nutrizione e scienza cosmetica.
