Целью данной статьи является предоставление подробного, пошагового визуального протокола для извлечения аквеозных метаболитов из культурных раковых клеток для последующего метаболомного анализа. Основным преимуществом этой техники является ее простота и надежность для извлечения метаболитов из адептов клеток. Но прежде всего, он хорошо оптимизирован для метаболомного анализа с использованием капиллярной электрофорез-масс-спектрометрии или CEMS.
Метаболомика является мощным методом для выявления биомаркеров или выявления рака на ранней стадии и прогнозирования химиотерапии ответ на больных раком. Мы используем раковые клетки в этой демонстрации. Тем не менее, этот метод также может быть применен для сбора метаболитов из других клеток-адептов, таких как фибробласты в клетках iPS.
Концентрации метаболита нормализуются в зависимости от количества жизнеспособных клеток. Так тщательная подготовка культуры, это ключ для получения хороших воспроизводимых данных. Демонстрацией процедуры будет Ами Маруяма, техник из моей лаборатории.
Для начала пластины HCC827 и PC-9 клетки в 100-миллиметровых блюдах, содержащих 10 миллилитров среднего RPMI-1640, дополнены 10%-процентной сывороткой крупного рогатого скота. Поместите блюда в инкубатор на 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов в культуру. После инкубации аккуратно наклоните 100-миллиметровые блюда культуры, чтобы аспирировать средства массовой информации клеточной культуры.
Вымойте клетки на каждом блюде, используя два миллилитров фосфатно-буферного солевого раствора без кальция и магния. Аккуратно раскачивайте каждое блюдо так, чтобы раствор PBS полностью покрывал поверхность блюда, а затем наклонял посуду, чтобы аспирировать буфер для мытья. Теплый 0,25%трипсин-ЭДТА решение до 37 градусов по Цельсию.
С пятими миллилитровой серологической пипеткой добавьте в каждое блюдо два миллилитров разогретого раствора трипсина-ЭДТА. Аккуратно раскачивайте каждое блюдо так, чтобы трипсин полностью покрывало поверхность блюда. Инкубировать блюда культуры при 37 градусах по Цельсию в течение примерно пяти минут.
Затем добавьте четыре миллилитров предварительно разогретой полной среды роста к каждому блюду. И аккуратно пипетки несколько раз, чтобы повторно приостановить клетки в среде. Перенесите каждую подвеску клетки в отдельную 15-миллилитровую коническую трубку.
Центрифуга по 800 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте каждую ячейку гранулы в двух миллилитров предварительно разогретой полной среды роста. Смешайте 10 микролитров клеточной подвески с 10 микролитров 0,4% трипан синий раствор, в 1,5-миллилитров микротрубки.
Загрузите 10 микролитров смеси в камеру подсчета клеток, проскользнув через капиллярное действие. Вставьте слайд камеры в автоматизированный счетчик ячейки и нажмите кнопку захвата, чтобы захватить изображение и отобразить результаты общего числа и процентов жизнеспособности ячеек. Если общее число клеток превышает 0,5 миллиона клеток на миллилитр, добавьте среду дальнейшего роста к 15-миллилитровой конической трубке, чтобы получить желаемую концентрацию клеток.
Теперь добавьте от двух до пяти миллилитров культуры к каждому 100-миллиметровому клеточному блюду культуры, чтобы посеять примерно от одного до 2 1/2 миллиона клеток на блюдо. Инкубировать культуру блюда в 5%углекислого газа при 37 градусов по Цельсию в течение 18 часов. Во-первых, в 15-миллилитровой томной колбе разбавляют коммерческий внутренний стандартный раствор, содержащий сульфон L-methionine и D-Camphor-10-сульфоновую кислоту в 1000 раз в ультрапурной воде.
Растворите маннитол в ультрапурной воде, чтобы подготовить 0,05 грамма на миллилитр раствора маннитола в ультрачистой воде в качестве буфера для мытья. Затем в фильтровальную чашку каждого центробежного фильтровального блока попадает пипетка 250 микролитров ультрачистой воды. Крышка фильтр единиц плотно, и центрифуга на 9, 100 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Проверьте громкость каждого фильтрата. Если значительный фильтрат накопился в течение первого короткого вращения, блок фильтра может быть дефектным. Откажитесь от блока фильтра и вместо этого используйте новый блок фильтра.
Закройте крышки фильтруемых блоков плотно и центрифуга снова на 9, 100 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Убедитесь, что ни в одной из чашек фильтра не остается ультрачистой воды, и удалите фильтрованную ультрачистую воду в каждой трубке коллекции с помощью пипетки. Поместите фильтр чашки обратно в их сбора труб, и использовать центробежные фильтр единицы в течение часа, чтобы избежать повреждений при сушке.
Вывихи из инкубатора 100-миллиметровые блюда культуры и аспирировать среду клеточной культуры из каждого блюда. Добавьте 10 миллилитров среды культуры PBS с или без 250 микромолярный диамид к каждому блюду, заботясь, чтобы не нарушить клеточный слой. Инкубировать блюда культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
После инкубации, аспирировать клеточной культуры среды из каждого 100-миллиметрового блюда культуры. Слегка наклоните блюдо и аккуратно добавьте два миллилитров буфера мытья 5%маннитол к краю каждого блюда, чтобы вымыть клетки, заботясь, чтобы не нарушить клеточный слой. Аспирировать буфер мытья из каждого блюда культуры, и мыть клетки снова слегка наклоняя блюдо и осторожно добавив 10 миллилитров мыть буфера на блюдо.
Затем полностью аспирировать буфер мытья от края каждого блюда культуры. Теперь добавьте 800 микролитров 99,7% метанола на блюдо культуры, и аккуратно качайте каждое блюдо культуры туда и обратно, чтобы покрыть всю его поверхность. Оставьте посуду при комнатной температуре на 30 секунд.
Медленно добавьте 550 микролитров разбавленного внутреннего стандартного раствора на блюдо, погрузив кончик пипетки в метанол и аккуратно трубя вверх и вниз, несколько раз. Аккуратно качайте каждое культурное блюдо туда и обратно, чтобы покрыть всю его поверхность, и оставьте посуду при комнатной температуре на 30 секунд. Затем перенесите извлеченный раствор из каждого культурного блюда в отдельную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Центрифуга труб при 2300 раз г при четырех градусах цельсия в течение пяти минут. Перенесите 700 микролитров каждого супернатанта в два центробежных фильтра с 350 микролитров на единицу. Центрифуга фильтруемые трубки при 9, 100 раз г при четырех градусах Цельсия в течение примерно двух часов, пока жидкость не останется в стаканчиках фильтра.
Снимите фильтр чашки, и плотно закрыть крышки сбора труб. В этом исследовании клетки HCC827 и PC-9 росли одинаково в течение трех часов. Анализ CEMS показывает разницу между клетками, обработанными диамидом, и клетками, обработанными PBS, для обеих клеточных линий.
Среди них, несколько промежуточных в пентозный фосфатный путь и в верхнем гликолизе были значительно выше в диамид-обработанных условиях, в то время как несколько трикарбоксиличного цикла промежуточных были ниже в обработанных условиях. Метаболомные профили внутриклеточных метаболитов выявили 175 и 150 дифференциальных метаболитов в клетках HCC827 и PC-9 соответственно. После лечения диамидом уровень глюконовой кислоты и окисленного глюкозы увеличился в 12 раз в клетках HCC827 и в 10 раз в клетках PC-9.
Аналогичным образом, уровень глюкозы 6-фосфат, фосфорилированной глюкозы в первом гексокиназы-катализа гликолиз продукта, также увеличилось в 6,3-и 3,5 раза в HCC827 и PC-9 клеток, соответственно. Кроме того, уровни 6-фосфоглуконата, первого промежуточного в пентозном фосфатном пути, резко возросли в 89 раз в клетках HCC827 и в 231 раз в клетках PC-9. В отличие от этого, уровни других гликолитических промежуточных веществ, таких как фруктоза 6-фосфат не изменился в диамид экспериментального состояния.
Общий уровень никотинамида аденина динуклеотида фосфата был почти эквивалентен между лечением диамида и условиями контроля PBS. Использование 5%mannitol раствор, кроме PBS, как мыть буфер для мытья клеток очень важно для анализа CEMS, потому что солевые буферы вмешиваться в анализ и отрицательно влияют на измерение. Этот протокол непригоден для извлечения гидрофобных метаболитов, таких как липиды, поэтому нам необходимо разработать протокол для удобного извлечения гидрофильных и гидрофобных метаболитов для более комплексного метаболомного анализа.
Этот метод реализует легкое извлечение метаболитов практически из любых клеток-адептов, и, таким образом, применим для различных исследований, таких как рак, стволовые клетки, фармакология, питание и косметическая наука.
