Der Zweck dieses Artikels ist es, ein detailliertes, schrittweises visuelles Protokoll für die Extraktion wässriger Metaboliten aus kultivierten Krebszellen für die nachfolgende Metabolomanalyse bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit und Zuverlässigkeit für die Extraktion von Metaboliten aus anhaftenden Zellen. Vor allem aber ist es für die Metabolom-Analyse mit Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie oder CEMS optimiert.
Metabolomics ist eine leistungsstarke Technik, um Biomarker zu identifizieren oder Krebs im Frühstadium zu erkennen und die Chemotherapie-Reaktion von Krebspatienten vorherzusagen. Wir verwenden Krebszellen in dieser Demonstration. Diese Technik kann jedoch auch zur Ernte von Metaboliten aus anderen anhaftenden Zellen wie Fibroblasten in iPS-Zellen angewendet werden.
Metabolitenkonzentrationen werden auf der Grundlage der Anzahl lebensfähiger Zellen normalisiert. So sorgfältige Vorbereitung der Kultur, ist dies der Schlüssel für die Erlangung guter reproduzierbarer Daten. Demonstriert wird das Verfahren von Ami Maruyama, einem Techniker aus meinem Labor.
Zunächst werden HCC827- und PC-9-Zellen in 100-Millimeter-Schalen mit 10 Millilitern RPMI-1640-Medium mit 10% fetalem Rinderserum auftellert. Legen Sie die Gerichte in einem Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 24 Stunden zu Kultur. Nach der Inkubation die 100-Millimeter-Kulturgerichte sanft kippen, um die Zellkulturmedien zu saugen.
Waschen Sie Zellen auf jeder Schale mit zwei Milliliterphosphat-gepufferten Saline-Lösung ohne Kalzium und Magnesium. Jede Schale vorsichtig schaukeln, so dass die PBS-Lösung die Oberfläche der Schale vollständig abdeckt, und kippen Sie dann die Teller, um den Waschpuffer zu aspirieren. Erwärmen Sie 0,25%Trypsin-EDTA Lösung auf 37 Grad Celsius.
Mit einer 5-Milliliter-Serologischen Pipette zwei Milliliter der erwärmten Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Schale hinzufügen. Jede Schale vorsichtig schaukeln, so dass das Trypsin die Oberfläche der Schale vollständig bedeckt. Die Kulturgerichte bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten bebrüten.
Dann fügen Sie vier Milliliter des vorgewärmten vollständigen Wachstumsmediums zu jedem Gericht hinzu. Und sanft Pipette mehrmals, um die Zellen in Medium wieder zu suspendieren. Übertragen Sie jede Zellsuspension in ein separates 15-Milliliter Konikonrohr.
Zentrifuge bei 800 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Zellpellet in zwei Milliliter des vorgewärmten gesamtwütigen Wachstumsmediums wieder auf. Mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern 0,4%Trypan-Blaulösung in einem 1,5-Milliliter-Mikrorohr.
10 Mikroliter des Gemischs durch Kapillarwirkung in eine Zellzählkammer gleiten lassen. Legen Sie das Kammergleiten in den automatischen Zellenzähler ein, und drücken Sie die Aufnahmetaste, um das Bild zu erfassen und die Ergebnisse der Gesamtzahl und der prozentualen Lebensfähigkeit der Zellen anzuzeigen. Wenn die Gesamtzellzahl über 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter liegt, fügen Sie dem 15-Milliliter-Konusrohr weiteres Wachstumsmedium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten.
Fügen Sie nun zwei bis fünf Milliliter der Kultur zu jeder 100-Millimeter-Zellkulturschale hinzu, um etwa ein bis zwei 1/2 Millionen Zellen pro Schale auszusäen. Inkubieren Sie die Kulturgerichte in 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden. Verdünnen Sie zunächst in einem 15-Milliliter-Volumenkolben eine kommerzielle interne Standardlösung, die L-Methionin-Sulfon und D-Camphor-10-Sulfonsäure 1.000-fach in Reinstwasser enthält.
Mannitol in Reinstwasser auflösen, um eine 0,05 Gramm pro Milliliter Mannitollösung in Reinstwasser als Waschpuffer vorzubereiten. Dann in den Filterbecher jeder Zentrifugalfiltereinheit, Pipette 250 Mikroliter Reinstwasser. Die Filtereinheiten fest verschließen und bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren.
Überprüfen Sie die Lautstärke jedes Filtrats. Wenn sich während der ersten kurzen Drehung erhebliche Sfiltrate angesammelt haben, kann die Filtereinheit defekt sein. Verwerfen Sie die Filtereinheit, und verwenden Sie stattdessen eine neue Filtereinheit.
Schließen Sie die Deckel der Filtereinheiten fest und zentrieren Sie wieder bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie sicher, dass kein Reinstwasser in einem der Filterbecher verbleibt, und entfernen Sie das gefilterte Reinstwasser in jedem Sammelrohr mit einer Pipette. Legen Sie die Filterbecher wieder in ihre Sammelrohre und verwenden Sie die Zentrifugalfiltereinheiten innerhalb einer Stunde, um Schäden beim Trocknen zu vermeiden.
Nehmen Sie die 100-Millimeter-Kulturgerichte aus dem Brutkasten und aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jedem Gericht. Fügen Sie 10 Milliliter PBS-Kulturmedium mit oder ohne 250 Mikromolar-Diamid zu jeder Schale hinzu, wobei darauf geachtet wird, die Zellschicht nicht zu stören. Inkubieren Sie die Kulturgerichte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus jedem 100-Millimeter-Kulturgericht ansaugen. Kippen Sie die Schale leicht, und fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter 5%Mannitol Waschpuffer an den Rand jeder Schale, um die Zellen zu waschen, wobei darauf zu achten, die Zellschicht nicht zu stören. Den Waschpuffer von jeder Kulturschale ansaugen und die Zellen wieder waschen, indem man die Schale leicht neigt und sanft 10 Milliliter Waschpuffer pro Schale hinzufügt.
Dann, vollständig aspirieren Sie den Waschpuffer vom Rand jeder Kulturschale. Fügen Sie nun 800 Mikroliter 99,7% Methanol pro Kulturgericht hinzu und schaukeln Sie jedes Kulturgericht sanft hin und her, um seine gesamte Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie das Geschirr bei Raumtemperatur für 30 Sekunden.
Fügen Sie langsam 550 Mikroliter der verdünnten internen Standardlösung pro Schale hinzu, indem Sie die Spitze der Pipette in das Methanol eintauchen und mehrmals sanft nach oben und unten pfeifen. Schaukeln Sie jedes Kulturgericht sanft hin und her, um seine gesamte Oberfläche zu bedecken, und lassen Sie das Geschirr bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Dann übertragen Sie die extrahierte Lösung aus jeder Kulturschale in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 2, 300 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie 700 Mikroliter jedes Überstandes in zwei Zentrifugalfiltereinheiten mit 350 Mikroliterpro Einheit. Zentrifugieren Sie die Filterrohre bei 9, 100 mal g bei vier Grad Celsius für etwa zwei Stunden, bis keine Flüssigkeit in den Filterbechern verbleibt.
Entfernen Sie die Filterbecher, und schließen Sie die Deckel der Sammelrohre fest. In dieser Studie wuchsen HCC827 und PC-9 Zellen drei Stunden lang gleichmäßig. Die CEMS-Analyse zeigt die Differenz zwischen diamidbehandelten Zellen und PBS-behandelten Zellen für beide Zelllinien an.
Darunter waren mehrere Zwischenprodukte im Pentosephosphatweg und in der oberen Glykolyse bei den mit Diamid behandelten Bedingungen signifikant höher, während einige tricarbonylische Zykluszwischenprodukte in den behandelten Bedingungen niedriger waren. Metabolomprofile intrazellulärer Metaboliten zeigten 175 bzw. 150 Differentialmetaboliten in HCC827- bzw. PC-9-Zellen. Nach der Diamidbehandlung erhöhte sich der Gehalt an Gluconsäure und oxidierter Glukose in HCC827-Zellen um das 12-fache und in PC-9-Zellen um das 10-fache.
In ähnlicher Weise erhöhte sich der Gehalt an Glucose 6-Phosphat, einer phosphorylierten Glukose im ersten Hexokinase-katalysierten Glykolyseprodukt, ebenfalls in HCC827- bzw. PC-9-Zellen um das 6,3- bzw. 3,5-fache. Darüber hinaus stiegen die Konzentrationen von 6-Phosphogluconate, dem ersten Zwischenprodukt im Pentosephosphatweg, in HCC827-Zellen und dem 231-fachen in PC-9-Zellen dramatisch um das 89-fache. Im Gegensatz dazu änderten sich die Konzentrationen anderer glykolytischer Zwischenprodukte wie Fructose 6-Phosphat im diamidexperimentellen Zustand nicht.
Die gesamten Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Werte waren nahezu gleichwertig zwischen der Diamidbehandlung und den PBS-Kontrollbedingungen. Die Verwendung von 5%mannitol Lösung, außer PBS, als Waschpuffer für Waschzellen ist sehr wichtig für die CEMS-Analyse, da salzbasierte Puffer die Analyse stören und die Messung beeinträchtigen. Dieses Protokoll ist ungeeignet für die Extraktion hydrophober Metaboliten wie Lipide, daher müssen wir ein Protokoll entwickeln, um sowohl hydrophile als auch hydrophobe Metaboliten bequem für eine umfassendere Metabolomanalyse zu extrahieren.
Diese Technik realisiert eine einfache Extraktion von Metaboliten aus fast allen anhaftenden Zellen und ist daher für eine Vielzahl von Forschungen wie Krebs, Stammzellen, Pharmakologie, Ernährung und Kosmetische Wissenschaft anwendbar.
