هذه الطريقة تقيس مستويات منظم عالمي ppGpp في ظل ظروف النمو المختلفة وحالات الإجهاد. يمكن العثور على PpGpp في البكتيريا الإيجابية والسلبية غرام، وكذلك في chloroplast. PpGpp لديه بداية سريعة في ثوان، مما يؤدي إلى علاقة ثانية سريعة بمجرد إنتاج الإجهاد.
في الوقت نفسه، لديها نصف عمر قصيرة، تصل إلى 30 ثانية. لذلك، هناك حاجة لمراقبة العديد من الثقافة في فترات زمنية قد تختلف من 10 ثانية إلى ساعات، بما في ذلك انتقالات التشديد. نحن أيضا الثقافات البكتيرية radiolabel في أطباق microtiter يسهل أخذ عينات عالية الإنتاجية التي تسمح تكرارات تقنية وبيولوجية متعددة.
تأكد من اتباع تدابير السلامة المناسبة عند العمل مع المواد المشعة. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد كافة الوسائط كما هو موضح في بروتوكول النص. تنمو بين عشية وضحاها الثقافات في وسائل الإعلام MOPS مع ثلاثة ملليمولار فوسفات الصوديوم.
إضافة 550 ميكرولترات من وسائل الإعلام MOPS، contining 0.2 ناقلة فوسفات الصوديوم ميكرومولار و 30 ميكرولترات من كل inoculum البكتيرية إلى آبار 24 لوحة بئر. وهذا سيؤدي إلى تلقيح أولي مع OD600 من 0.1. إضافة وسائط جديدة إلى واحد وكذلك التحكم في العقم.
ضع الطبق في حاضنة اهتزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، واهتز عند 900 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. يمكن رصد النمو باستخدام قارئ لوحة مع لوحة تكرار بالتوازي في وسائل الإعلام تفتقر P32 باستخدام قارئ لوحة في حين احتضان في ظل نفس الظروف. بعد ذلك، إضافة 100 microcuries من p32 أوفوسفات إلى كل بئر من لوحة.
تنمو الثقافات في حاضنة تهتز لمدة 1-2 doublings للسماح للتسمية الخارجية لتكواز إلى حد كبير مع برك النيوكليوتيدات بين الخلايا. للتصور الصحيح، لم يتم استخدام أي من المواد النشطة في هذا الفيديو. في تجربة حقيقية، مطلوب التدريع السليم، فضلا عن الرصد المستمر للتلوث مع مقياس المسح.
أولاً، الحث على الإجهاد باستخدام طريقة مناسبة لهذا النوع من الإجهاد المدروس. بعد ذلك، أضف 20 ميكرولترات من كل عينة خلية تحمل علامة إلى أنبوب PCR منفصل 0.2 ملليلتر، يحتوي على 20 ميكرولترات من حمض الجليد البارد ستة حمض الفضور. ضع العينات على الفور على الجليد الجاف.
تعزيز كفاءة استخراج الخلوية من قبل ثلاث دورات من التجميد والذوبان. قبل اكتشاف PEI السليلوز رقيقة طبقة الكروماتوغراف، وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة دقيقة واحدة في السرعة القصوى ل بيليه خلية الحطام. أولا، المنصوص عليها 20 في 20 سم PEI السليلوز TLC لوحة.
استخدام مقص لإزالة أعلى خمسة سنتيمترات. واستخدم قلم رصاص ناعم لوضع علامة على خط أصل سنتيمتر واحد من الحافة. تطبيق 5 ميكرولتر قطرات من كل عينة على سطح PEI.
قبل أن يمكن أن يجف البقعة، نقل لوحة إلى خزان يحتوي على طبقة من 1.5 فوسفات أحادي بوتداسيوم المولر التي هي ضحلة بما يكفي لا للمس بقعة عينة الأصل. غطي الخزان بختم محكم، واتّسم بالصعود السائل إلى أعلى الورقة المشذبة التي يبلغ طولها 15 سنتيمترًا. بعد ذلك، قم بإزالة الكروماتوغرافية المطورة بالكامل وجففه الهواء في درجة حرارة الغرفة.
قطع والتخلص من الجزء العلوي من الكروماتوغرام التي تحتوي على P32 الحرة إلى النفايات المشعة. استخدام شاشة الفوسفور لفضح الأفلام السمعية اديوغرافية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بتطوير الفيلم واستخدم صورة فوسفورية لالتقاط وكميات الإشارة الخضراء للفوسفور.
ثم، استخدم برنامج ImageJ لكميات البقع المشعة. بعد إثارة الإجهاد أو المجاعة لوقت كاف للسماح ppGpp تراكم، واستخدام طريقة مناسبة لعكس الإجهاد. أخذ العينات كل 20 إلى 30 ثانية لمدة تصل إلى دقيقتين ومعالجة العينات كما هو موضح سابقا.
بمجرد تطوير TLC ، ويتم الحصول على مستويات ppGpp خلال الدورة الزمنية ، قم برسم محتوى ppGpp المتبقي على مؤامرة semilogarithmic مقابل الوقت. في هذه الدراسة، وتوصف الخلايا التي تزرع في MOPS تحتوي على جميع الأحماض الأمينية باستثناء ILV مع P32. مرة واحدة وصفت، L فالين يضاف لإنتاج تجويع isoleucine.
بعد خمس دقائق، حدثت زيادة قديمة اثنين واثنين ونصف في مستويات رباعية وخمات فوسفات من جوانوسين. يتم استخدام التحكم السلبي في عينة خالية من الخلايا المسماة للكشف عن المركبات المحتملة التي لا تُستخدم في مصدر P32. يمكن أن يتحقق عكس تجويع الليسوليوسين من قبل الكلوراففينيكولول، وهو مثبط تخليق البروتين، مما يقلل من استهلاك الحمض النووي الريبي المشحون، وبدوره، يعيد نسب عالية من مشحونة إلى trna غير مشحونة.
يتم إلغاء تنشيط ppGpp synthetase قوية بوساطة rela، مما يسمح بمقياس لتحلل ppGpp غير مُنَقَّط بالتوليف المتبقي. في هذه الحالة، ينحل ppGpp مع نصف عمر حوالي 64 ثانية. من المهم أن ندع الخلايا تنمو لبضعة أجيال لتحقيق وضع العلامات موحدة قبل الحث على أي الإجهاد أو المجاعة.
لأن ppGpp ينتشر على نطاق واسع بين البكتيريا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الكائنات الحية الأخرى. ويمكن أن يسمح تعديل طريقة تطوير TLC بالفصل السليم بين جميع النيوكليوتيدات التنظيمية، مثل ppApp. P52 هو أفضل النظائر الباعثة، لذلك من المهم استخدام التدريع السليم والتخلص بشكل صحيح من أي بقايا.
