نشكر وزارة الامن الداخلي الامريكية لتوفير جزء من التمويل.

1. البكتيرية سلالات الحمض النووي وإعداد قالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو سلالات البكتيرية E. كولاي O157: H7، غير O157، والأنواع المسببة للأمراض الأخرى، مثل السالمونيلا والشيجلا، عند 37 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي من الثقافات البكتيرية باستخدام عدة المناسبة (انظر الجدول المواد)، وبعد تعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة الضوئية (OD 260) لتحديد تركيز الحمض النووي باستخدام معمل. </li></ol> 2. التمهيدي والتصميم التحقيق لفحص QPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاي O157: H7 هي متواليات من بنك الجينات عدد AE00517411 الانضمام. الاشعال تصميم والتحقيق استخدام البرمجيات المناسبة لتصميم التمهيدي والتحقيق في الوقت الحقيقي PCR (انظر الجدول مواد للتفاصيل). تسلسل الاشعال والتحقيق هي كما يلي: Z3276 إلى الأمام (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-عكسي (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276 دقق، FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل مسحوق التمهيدي مع الماء، مما أدى إلى تركيز من 10 ميكرومتر كحل العمل التمهيدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التحقيقات إلى 10 ميكرومتر كحلول عمل التحقيق. تحقيقات المسمى تختلف في قوتها مع دفعات. وبالتالي، يعاير كل دفعة من تحقيقات وصفت قبل استخدام لأفضل أداء QPCR. </li></ol> 3. وضع شروط الفحص QPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل، الذي يتكون من 25.0 ميكرولتر من 2X في الوقت الحقيقي PCR مزيج الرئيسي، و 200 نيوتن متر من التمهيدي إلى الأمام، و 200 نيوتن متر من التمهيدي العكسي، و 100 نيوتن متر من التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي العينة (100 خريج) وحجم مناسب من الماء للوصول إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل السيطرة nontemplate، استخدم 5 ميكرولتر من المياه ليحل محل عينة من الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهيئة الظروف QPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفعيل TaqMan، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية لتمسخ و 60 و# 176؛ مئوية لمدة 1 دقيقة للالصلب / التمديد. </li></ol> 4. QPCR حساسية اختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المسلسل التخفيف 10 أضعاف من ثقافة مرحلة منتصف الأسي (OD 600 = 0.5؛ حوالي 1.5 × 10 8 كفو / مل بواسطة الطلاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من التخفيفات الخلية على طبق من ذهب 96 جيدا في ثلاث نسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 مل من محلول استخراج الحمض النووي إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات الخلايا في resuspend مع ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم، وتغلي لوحة في حمام مائي لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 2 دقيقة. </li></ol> 5. إعداد الحية والميتة خلطات الخليوي لسلطة النقد الفلسطينية العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو 10 مل من E. كولاي O157: H7 في 37 درجة مئوية إلى منتصف المرحلة الأسي وتقسيم الثقافة إلى قسمين مأخوذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي قسامة واحدة من خلايا لمدة 10 دقيقة في حمام مائي لالخلايا الميتة وترك قسامة الأخرى للخلايا الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق منإعادة توجد الخلايا الحية من قسامة قتلت الحرارة عن طريق طلاء الخلايا على لوحات أجار LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 2 مل من الخلايا الحية وقتلت الحرارة وضبط تركيز على 8 × 10 6 كفو / مل مع LB المتوسطة. إنشاء أربع مجموعات من التخفيفات الخلية تتراوح بين 8 × 10 0-8 × 10 6 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أول مجموعتين من التخفيفات الخلية للخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية أو غير المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى مجموعات الثالثة والرابعة من التخفيفات الخلية، إضافة 8 × 10 6 الخلايا الميتة إلى كل خلية التخفيف (8 × 10 0-8 × 10 6) لجعل مخاليط الخلية الحية والميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج مجموعة ثالثة من التخفيف مع سلطة النقد الفلسطينية واستخدام المجموعة الرابعة من التخفيف من أجل السيطرة. </li></ol> 6. علاج الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل سلطة النقد الفلسطينية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (أو الماء) لجعل محلول المخزون 10 ملي وتخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 400 ميكرولتر من الخلايا الحية والخلايا الميتة، وخليط من الخلايا الحية والميتة فيثلاثة microtubes منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.0 مل من 10 ملي سلطة النقد الفلسطينية إلى كل قسامة خلية إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام، والهز بلطف عدة مرات، 3 ثانية في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العينات على لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم البصرية ووضع لوحة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط لوحة 20 سم من W الهالوجين مصدر الضوء وفضح 650 لمدة 2 دقيقة لالتعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل بلطف طاف واستنزاف لوحة على قطعة من الورق استيعاب بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كريات الخلية resuspend في 50 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي من قبل pipetting صعودا وهبوطا عشرين مرة مع متعدد القنوات Pipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم، وتغلي لمدة 10 دقيقة في حمام مائي، وأجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 2 دقيقة. طاف في لوحة هو الحمض النووي من خلايا تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وعلى استعداد للQPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء QPCR كما descriالفراش أعلاه، وذلك باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

والهدف الأساسي من هذه الدراسة تنطوي على استخدام لORF Z3276، وهي فريدة من نوعها لE. كولاي O157: H7، والعلامات البيولوجية الوحيد لQPCR الفحص. في الوقت الحاضر، فإن معظم المقايسات QPCR تستهدف الجينات الفوعة، مثل stx1، stx2، وeaeA 1،2،5،6 أو الجينات المظهرية المشتركة، مثل uidA 3،4، rfbE والجينات فليك 8،9. في بعض الأحيان، وهي من الأنواع أو السلالة لا يمكن تحديدها بالتأكيد بواسطة الجينات الفوعة (ق)، مثل STX 1and STX 2 الجينات، كما هي موجودة في الأنواع أو السلالات المختلفة 16 وكذلك تلك الجينات. باستخدام rfbE وفليك عن الجينات المستهدفة، وهناك حاجة إلى كل من الجينات لاستخدامها في هوية كاملة 17. باستخدام ORF Z3276 والعلامات البيولوجية، وقد تجلى هذا الاختبار QPCR أن يكون الفحص حساسة ومحددة (الجدول 1). وقد تعرض هذا الاختبار لصرامة الشمولية والتفرد الاختبارات، بما في ذلك O157: H7 سلالات (ن = 367)، أكثر من 100 السلالات غير O157، والأنواع المسببة للأمراض الأخرى، مثل السالمونيلا والشيجلا. تم الكشف عن H7 سلالات درست بشكل إيجابي، وعثر على عدم تفاعل عرضية من سلالات غير O157 (الجدول 1)، مشيرا إلى أن ORF Z3276 هي العلامات البيولوجية فريدة وقوية للكشف عن E.: جميع O157 O157 كولاي: H7. الهدف الآخر من هذه الدراسة هو الكشف عن انتقائي الخلايا الحية من الخلايا الميتة عن طريق العلاج قبل سلطة النقد الفلسطينية استخراج الحمض النووي. سلطة النقد الفلسطينية يمكن أن تخترق الخلايا الميتة مع غشاء للخطر وربط الحمض النووي، وبالتالي يحول دون تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة في PCR 13. قمنا بتعديل الإجراء سلطة النقد الفلسطينية المعاملة، وتكييفه لشكل لوحة 96 جيدا لهذا الإجراء. كثافة حق التعرض للضوء هو ضروري للحصول على أفضل تأثير عبر ربط. سابقا، وقد استخدمت في هذه الخطوة microtubes 13-15. ومع ذلك، microtubes منفصلة يصعب التعامل معها في ضوء السابقينالخطوة posure، وهذه الأنابيب ليست شفافة تماما للحصول على أفضل تروق الصليب. باستخدام لوحة 96 جيدا، قمنا بتحسين كفاءة PMA-العلاج. هذه التغييرات قد تؤثر على الفحص في عدة طرق: أنها تجعل من السهل للحصول على تأثير ربط عبر شاملة وموحدة، وخاصة مع عينات عديدة؛ يمكن نقل عينات المعالجة من لوحة إلى أخرى لتجعل من الممكن للكشف عن عدد كبير العينات، وأنها توفر هذا الاختبار PMA-QPCR مع إمكانات أتمتة العملية برمتها ل. الحد من هذا الاختبار PMA-QPCR هو أن سلطة النقد الفلسطينية العلاج يزيد من تكلفة فحص PCR نوعا ما وانخفاض طفيف حساسية فحص PCR.

PCR هي تقنية شائعة للكشف عن E. كولاي O157: H7 من العينات الغذائية والبيئية. تحديد المؤشرات الحيوية محددة لE. كولاي O157: H7 هي واحدة من العوامل الرئيسية لنجاحها في الكشف عن المقايسات PCR. المؤشرات الحيوية التي تستخدم عادة في المقايسات PCR للكشف عن E. كولاي O157: H7 تشمل السموم شيغا (STX 1 و 2 STX) 1،2، 3،4 uidA، eaeA 5،6، rfbE 7، وفليك الجينات 8،9. ويمكن لهذه المؤشرات الحيوية توفير الكفاءة لتحديد متغير، ومع ذلك، فإن معظم المؤشرات الحيوية لا يمكن أن تستخدم العلامات البيولوجية فريدة من نوعها للكشف عن E. O157 كولاي: H7. هذا القصور في السلطة التفريق بين الجينات المستهدفة يدعو العلامات البيولوجية أكثر تحديدا وأقوى (ق) لتحديد E. O157 كولاي: H7 10. تحقيقات عديدة للجينات أو إطارات القراءة المفتوحة افتراضية (ORFS) في E. القولونيةO157: H7 تم تصميمها ل11 QPCR مقايسة على أساس القرائن من ميكروأرس التنميط الجيني DNA من مختبرنا وخلال البحث في قاعدة بيانات بنك الجينات من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية. وقد تم اختيار تسلسل Z3276 ORF، وهو الجين خملي 11، لQPCR الفحص. بعد ذلك، تم تطوير فحص QPCR من خلال العديد من التجارب على المعلمات PCR مثل تركيزات الاشعال وتحقيقات، فضلا عن الصلب والإرشاد درجات الحرارة (لا تظهر البيانات). بعد الشمولية والتفرد حافز اختبارات على السلالات المرجعية مثل E. كولاي O157: H7، غير O157 والشيجلا سلالات في QPCR، تم التعرف على ORF Z3276 كعلامة وراثية محددة وقوية لتحديد E. O157 كولاي: H7. ثم نطور طريقة جديدة باستخدام QPCR هذه العلامات البيولوجية فريدة لتحديد E. O157 كولاي: H7. تحد آخر في الكشف عن E. كولاي O157: H7 في الملوثة FOالمواد المستنفدة للأوزون والبيئة هو تحديد دقيق للخلايا الحية من العينات. وجود مدد من الحمض النووي من الخلايا الميتة وعدم القدرة على التفريق الجدوى في فحص PCR يمكن أن يسبب قراءات إيجابية كاذبة، مما أدى إلى المبالغة في تقدير أعداد الخلايا الحية في الكشف. بالتالي، وهذا يحد من استخدام PCR في الكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية دقيقة 12. وقد اتخذت نهجا جديدا للتمييز الحمض النووي من الخلايا الميتة من خلال الجمع بين propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج مع إجراء PCR في السنوات القليلة الماضية 13-15. سلطة النقد الفلسطينية قادرة على الذهاب إلى الداخل من الخلايا الميتة، ويقحم في الحمض النووي عند تعرضها للضوء، ولكن لا يمكن أن تذهب داخل الخلايا الحية لتتفاعل مع الحمض النووي للخلايا الحية. وهكذا، في خليط من سلطة النقد الفلسطينية المعاملة من الخلايا الحية والميتة، والحمض النووي من خلايا ميتة لا يمكن تضخيم PCR في 13. نحن الجمع بين العلاج مع سلطة النقد الفلسطينية QPCR مقايسة وضعت حديثا للكشف عن انتقائي الحية E. كولاي O157: H7 الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، حققنا سلطة النقد الفلسطينية، وQPCRssay ممكن للكشف عن إنتاجية عالية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

فريد إطار القراءة المفتوح تم تحديد (ORF) Z3276 كعلامة وراثية محددة لE. O157 كولاي: H7. وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR E. كولاي O157: H7 من خلال استهداف ORF Z3276. مع هذا الاختبار، ونحن يمكن الكشف منخفضة تصل إلى بضع نسخ من جينوم الحمض النووي من E. O157 كولاي: H7. وتأكدت حساسية وخصوصية الفحص عن طريق اختبارات التحقق من صحة مكثفة مع عدد كبير من E. كولاي O157: H7 سلالات (ن = 369) وسلالات غير O157 (ن = 112). وعلاوة على ذلك، ونحن تضافرت propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) الإجراء مع بروتوكول QPCR وضعت حديثا للكشف الانتقائي للخلايا الحية من الخلايا الميتة. التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الميتة سلطة النقد الفلسطينية المعاملة كانت تحول دون بالكامل تقريبا على النقيض من التضخيم تتأثر تقريبا من الحمض النووي من الخلايا الحية سلطة النقد الفلسطينية المعاملة. بالإضافة إلى ذلك، تم تعديل البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة التعامل ويتفق عدد كبير من العينات. Tومن المتوقع أن يكون لها تأثير على الميكروبيولوجية دقيقة والرصد الوبائي لسلامة الأغذية ومصدر بيئي طريقته.

الكشف عن E. كولاي O157: H7 من قبل QPCR باستخدام ORF Z3276 واحدة من العوامل الرئيسية لهذا الاختبار هو حساسية وخصوصية التحقيق Z3276 المستخدمة في QPCR. فإنه يمكن الكشف منخفضة تصل إلى عدد قليل من النسخ من جينوم الحمض النووي من E. كولاي O157: H7 كما هو مبين في الشكل 1A. من 120 سلالة O157 غير المدروسة، بما في ذلك السلالات الست الكبرى غير O157 STEC، O104: H4 سلالات، السالمونيلا، والسلالات الشغيلة، وجد عدم تفاعل الصليب، كما هو مبين في الجدول رقم 1. مزيج من العلاج مع سلطة النقد الفلسطينية QPCR التفقيس E. كولاي O157: تم اختيار الخلايا H7 مع سلطة النقد الفلسطينية (50 ملم) لمدة 5 دقائق في الظلام وتعريض للضوء لمدة 2 دقيقة للظروف العلاج سلطة النقد الفلسطينية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا تعديل الإجراء العلاج سلطة النقد الفلسطينية. مقارنة مع مختلف microtubes شفافة تستخدم في خطوة عبر ربط، تم العثور على لوحة 96 جيدا لتكون أكثر كفاءة لوصول إلى الأمثل تأثير ربط عبر وأكثر ملاءمة من التعامل مع عدد كبير من أنابيب العينات خلال عملية التعرض للضوء. التضخيم من الحمض النووي من سلطة النقد الفلسطينية معاملة الخلايا الحية والميتة في QPCR عرضت آثار تثبيط سلطة النقد الفلسطينية بوساطة من التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الميتة على هذا الاختبار QPCR في الشكل 1 باستخدام الحمض النووي المستمدة من اثنين المسلسل 10 أضعاف التخفيفات خلية حية أو ميتة. بينت النتائج أن منحنيات المتولدة من الخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية (المنحنى الأحمر) ودون سلطة النقد الفلسطينية (المنحنى الأزرق) يبدو الخطية ومتطابقة تقريبا مع بعضها البعض. عرضت الاختلافات قيمة CT طفيف بين الخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون (الشكل 1A)، مما يشير إلى أن العلاج سلطة النقد الفلسطينية لم يكن لها أثر يذكر على التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الحية في QPCR. ولكن 15 - الفرق قيمة CT (32،000 أضعاف) وقد تبين بين الخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون التجريبيnstrating أن العلاج سلطة النقد الفلسطينية قمعت بكفاءة تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة (الشكل 1B). الكشف عن الخلايا الحية من خليط من الخلايا الحية والميتة في QPCR وعولج مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية للكشف عن الخلايا الحية من العيش / مخاليط خلية ميتة - مجموعتين من التخفيفات الخلية الحية (8 × 10 6 × 10 8 كفو 0). أظهرت نتائج QPCR (الشكل 2A) اتجاه التدريجي عكسية موازية من القيم المقطعية فيما يتصل أعداد الخلايا الحية المعالجة (قضبان الأرجواني) للعينات غير المعالجة (أشرطة زرقاء). الخلايا الحية تعامل أسفرت عن القيم CT أعلى إلى حد ما من تلك الخلايا الحية دون علاج. ولوحظ وجود اتجاه التدريجي عكسية مماثلة في القيم CT مع العدد الحقيقي للخلايا الحية في حي مخاليط خلية ميتة / تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية (أشرطة خضراء)، وكذلك في الشكل 2B. بالإضافة إلى ذلك، كان هذا الاتجاه النزولي القيم CTلاحظ مع عدد الخلايا الحية في مخاليط الرغم من وجود 106 الخلايا الميتة. وأظهرت هذه النتائج أن القيم CT من العيش / مخاليط خلية ميتة يمثل الحمض النووي من الخلايا الحية وحدها، في حين أن تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة قمعت بشكل فعال من قبل سلطة النقد الفلسطينية العلاج. ولكن، وتقلبت القيم CT يعيش خليط من الخلايا الميتة / تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وفشلت في عكس أرقام الخلية الحية في مخاليط في الشكل 2B (أشرطة الصفراء). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> الشكل 1. العيش والخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية في QPCR الفحص. (A) مسلسل من 10 أضعاف المخفف الحية E. كولاي O157: H7 التخفيفات الخلية (8 × 10 0-8 × 10 6 كفو) عولج مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية.القيم CT تمثل متوسط ​​القيم CT من يثلث في مقايسة QPCR. (ب) مقارنة بين تضخيم الحمض النووي من الخلايا الحية والخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون في المقارنة ف QPCR الفحص. ΔRn يشير إلى تغير كثافة مضان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> الشكل 2. وأدلى كما هو مبين - تمايز الخلايا الحية من العيش / مخاليط الخلية برصاص PMA-QPCR أربع مجموعات من التخفيفات 10 أضعاف من الثقافات الخلية (8 × 10 6 × 10 8 كفو 0). كان يعامل (A) أول مجموعة من الخلايا التخفيف مع سلطة النقد الفلسطينية في حين كان التخفيف الخلية الثانية أو غير المعالجة قبل استخراج الحمض النووي.(ب) كانت مختلطة 8 × 10 6 الخلايا الميتة مع مجموعات الثالثة والرابعة من التخفيفات الخلية لجعل مجموعتين من العيش / مخاليط خلية ميتة كما هو مبين. كان يعالج مجموعة واحدة من خليط الخلية مع سلطة النقد الفلسطينية وكان يعالج مجموعة أخرى دون سلطة النقد الفلسطينية قبل استخراج الحمض النووي. يمثل كل شريط متوسط ​​القيم CT من تجربة ثلاث نسخ ± SD. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كائن حي </td><td> النمط المصلي </td><td> عدد سلالات اختبار </td></tr><tr><td rowspan="15"> كولاي </td><td> 2006 السبانخ O157: H7 اندلاع العزلات </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 تاكو بيل O157: H7 العزلات </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 تاكو جون O157: H7 العزلات </td><td> 11 </td></tr><tr><td> مجموعات سلالة O157 DMB من غيرها: تفشي H7 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> Ø111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Ø45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> آخر </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> السالمونيلا </td><td> التيفية </td><td> 1 </td></tr><tr><td> نيوبورت </td><td> 2 </td></tr><tr><td> الشيجلا الزحارية </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> الشيجلا السونية </td><td> غير معروف </td><td> 2 </td></tr><tr><td> الشيجلا الفلكسنرية </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> الشيجلا البويدية </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> مجموع </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tقادرة 1. سلالات تستخدم للتحقق من صحة في الوقت الحقيقي PCR مقايسة لتحديد E. O157 كولاي: H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR كولاي O157: H7 استهداف علامة جينية فريدة، Z3276. تم الجمع بين QPCR مع propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج للكشف عن الخلية الحية. تم تعديل هذا البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة ومتسقة التعامل مع عينات عديدة

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

detection-of-live-escherichia-coli-o157h7-cells-by-pma-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K Views.  Food and Drug Administration.  وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR كولاي O157: H7 استهداف علامة جينية فريدة، Z3276. تم الجمع بين QPCR مع propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج للكشف عن الخلية الحية. تم تعديل هذا البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة ومتسقة التعامل مع عينات ?...

Video: Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.