دراسة عدوى Cryptosporidium في أنظمة الثقافة العضوية البشرية المشتقة من الأنسجة ثلاثية الدناطية عن طريق الحقن المجهري

باستخدام هذا تنقية sporozoite والإجراءات الحقن المجهري، أساسا أي ميكروب مضيف يمكن دراسته في أي نظام الجهاز المستمدة من الأنسجة. باستخدام هذه التقنية، يمكننا التحكم في كمية الـ sporozoites النقية المحقونة في تجويف الأعضاء أو الجانب العضلي من الجهاز العضوي. لتنقية سي بارفوم sporozoites، نقل البويضة إلى أنبوب 15 ملليلتر و resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى بويضية السابعة لكل ملليلتر التركيز المتوسط excystation.

بعد 60 إلى 90 دقيقة في 37 درجة مئوية، مزيج 14 ملليلتر من محلول الغسيل المناسب مع البويضات، ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. التعرق بعناية لتجنب فقدان البويضات و resuspend بيليه sporozoic في ثلاث مرات 10 إلى البويضة السابعة لكل واحد إلى مليلتر اثنين من تركيز DMEM. لإزالة أي بويضات وقذائف متبقية، ضع برميل حقنة 10 ملليلتر مجهز بجهاز حامل مرشح 47 ملليلتر مزود بمصفح بولي كربونات بحجم ثلاثة ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر عند أربع درجات مئوية.

إضافة 7.5 ملليلتر من تعليق sporozoite إلى تجميع التصفية. عندما تم تمرير وحدة التخزين بأكملها من خلال مصفاة من الجاذبية، وغسل أي الخلايا المتبقية من خلال مصفاة مع آخر 7.5 ملليلتر من DMEM. عندما مرت كل من غسل من خلال مصفاة، وجمع تعليق sporozoite المصفاة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق وتسمية بيليه في 50 إلى 100 ميكرولترات من متوسطة الثقافة العضوية المناسبة، وتستكمل مع 0.05٪ صبغة خضراء سريعة، وL-الجلوتاثيون، بيتاين، L-سيستين، حمض اللينوليك، والتورين التي تحتوي على الحد من العازلة.

لmicroinject الطفيليات في الجانب apical من organoid 3D ، استخدم أولا سحب micropipette لإعداد الشعيرات الدموية حقن الزجاج. استخدام ملقط لقطع غيض من شعرية إلى قطر 9 إلى 12 ميكرومتر لتمكين تدفق سهل من sporozoites أو oocysts، إذا اخترت لحقن البويضات مباشرة، واستخدام نصائح اللودر الصغير لملء كل شعري مع صبغة خضراء سريعة المسمى تعليق oocyst أو sporozoite. ثم، تحميل الشعرية الأولى المملوءة sporozoite في مجهر واستخدام المجهر المقلوب في التكبير 5x وضغط مستمر لmicroinject 100 إلى 200 نانولترات من التعليق في كل organoid.

ينتج عن بروتوكول excystation إصدار sporozoites من حوالي 70 إلى 80٪ من البويضات. ولذلك، فمن الضروري لتصفية قذائف البويضة المتبقية من خلال الترشيح ثلاثة ميكرومتر. إزالة ما يقرب من 100٪ من البويضات غير مفزّة.

وعلاوة على ذلك، إضافة صبغة خضراء يساعد على ضمان حقن جميع organoids، ويسمح التصور من organoids حقن لمدة 24 ساعة على الأقل بعد الحقن. على الرغم من أن هذه طريقة جيدة الممارسة، يمكن استخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي لضمان أن عملية excystation لم تلحق الضرر sporozoites أو البويضات. حقن كميات متساوية من البويضات في تجويف organoid يمكن أن تؤكد بصريا عن طريق التصوير المجهري بسيطة.

يمكن أيضًا استخدام مقايسات الفلور المناعية لاستكشاف أنواع الخلايا المصابة بواسطة Cryptosporidium. بعد إصابة الأعضاء المختلفة لمدة خمسة أيام ، يمكن تأكيد وجود sporozoites داخل البويضات عن طريق تجفيف جزء من البويضات على شريحة لاصقة ، وتحديد البويضات مع الميثانول ، والجمع بين تلطيخ DAPI مع جسم مضاد مناسب خاص بالبويضات. للحصول على أقصى النتائج، استخدم البويضات الطازجة، واستخدم نفس الشعيرات الدموية لجميع الحقن، وغير الوسائط كل يوم بعد الحقن.

باستخدام هذه التقنية ، بدأت مختبرات مختلفة الآن في استخدام الأجهزة لدراسة تفاعلات الميكروب المضيف. نحن ندرس commensals وكذلك مسببات الأمراض الأخرى في إعدادات الزراعة الدقيقة العضوية مماثلة. بما أن Cryptosporidium هو طفيلي بشري ، فمن المهم إجراء هذه التجارب وفقًا للوائح السلامة من المستوى 2.