このスポロゾアイト精製およびマイクロインジェクション手順を用いて、本質的に任意の宿主微生物が、任意の組織由来臓器系で研究され得る。この技術を用いて、オルガノイドの内腔またはオルガノイドの尖体側に注入される純粋なスポロゾイトの量を制御することができます。C.parvum sporozoitesを精製するには、ウーストシットを15ミリリットルチューブに移し、ミリリットル剥離培地濃度あたり10回から7番目のウーストシットで細胞を再懸濁する。
摂氏37度で60~90分後、適切な洗浄液をウーシストと14ミリリットル混合し、遠心分離により細胞を沈下する。上清を慎重に吸引して、ウーストシストを失うことを避け、SporozoicペレットをDMEM濃度の1〜2ミリリットルあたり3倍の10〜7番目のウースト胞で再懸濁させる。残りのウーシストとシェルを取り除くために、3マイクロメートルの孔サイズのポリカーボネートフィルターを取り付けた47ミリリットルのフィルターホルダー装置を装備した10ミリリットルのシリンジバレルを摂氏4度の15ミリリットルチューブに入れる。
7.5ミリリットルのスポロゾアイト懸濁液をフィルターアセンブリに加えます。全体のボリュームが重力によってストレーナーを通過したら、DMEMの別の7.5ミリリットルでストレーナーを通して残りの細胞を洗います。すべての洗浄がストレーナーを通過したら、濾過したスポロゾイト懸濁液を10分間遠心分離して回収し、適切なオルガノイド培地の50〜100マイクロリットルにペレットをラベル付けし、0.05%速緑色染料、L-グルタチオン、ベタイン、L-システイン、リノール酸、およびtola酸を含む。
3Dオルガノイドの補助側に寄生虫をマイクロインジェクトするには、まずマイクロピペットプーラーを使用してガラス注入毛細血管を調製する。鉗子を使用して毛細管の先端を9〜12マイクロメートルの直径に切断し、胞子またはウーストシストの流れが容易に可能にし、マイクロローダーの先端を使用して、ウーストシストまたはスポロゾアイト懸濁液とラベル付けされた速い緑色の染料で各毛細管を満たします。次に、最初のスポロゾイト充填毛細管をマイクロインジェクターにロードし、5倍の倍率で反転した顕微鏡を使用し、各オルガノイドに懸濁液の100〜200ナノリットルをマイクロ注入するために一定の圧力を使用します。
この排泄プロトコルは、胞子の約70〜80%からスポロゾイトの放出をもたらす。したがって、残りのウーシストシェルを3マイクロメートルのろ過によって除外することが不可欠です。全く100%の無嚢胞を取り除く。
さらに、緑色の色素の添加は、オルガノイドの全ての注入を確実にするのに役立ち、注射後少なくとも24時間は注入されたオルガノイドの可視化を可能にする。これはよく実践された方法ですが、走査電子顕微鏡を使用して、除菌プロセスが胞子やうっ子嚢胞に損傷を与えないようにすることができます。オルガノイド内腔への同量のウーシストの注入は、単純な顕微鏡イメージングによって視覚的に確認することができる。
免疫蛍光アッセイは、クリプトスポリジウムに感染している細胞の種類を探索するためにも使用できます。分化されたオルガノイドが5日間感染した後、ウーシスト内のスポロゾイトの存在は、オーシスストの一部を粘着スライドに乾燥させ、卵嚢をメタノールで固定し、DAPI染色を適切な卵嚢特異的抗体と組み合わせることによって確認することができる。最大の結果を得るには、新鮮なウースト胞を使用し、すべての注射に同じ毛細血管を使用し、注射後毎日培地を交換します。
この技術を用いて、様々な研究室がホストと微生物の相互作用を研究するためにオルガノイドを使用し始めています。私たちは、同様のオルガノイド微小培養の設定で、コメンサルだけでなく、他の病原体を研究しています。クリプトスポリジウムはヒト寄生虫であるため、レベル2の安全規則に従ってこれらの実験を行うことが重要です。
