Utilisant cette procédure de purification et de microinjection de sporozoite, essentiellement n’importe quel microbe d’hôte peut être étudié dans n’importe quel système d’organe tissu-dérivé. En utilisant cette technique, nous pouvons contrôler la quantité de sporozoites purs injectés dans le lumen organoïde ou le côté apical de l’organoïde. Pour purifier les sporozoites de C.parvum, transférez l’oocyste à un tube de 15 millilitres et résuspendez les cellules à une fois 10 à la septième concentration moyenne d’oocyste par millilitre excystation.
Après 60 à 90 minutes à 37 degrés Celsius, mélanger 14 millilitres d’une solution de lavage appropriée avec les oocystes, et sédimenter les cellules par centrifugation. Aspirez soigneusement le supernatant pour éviter de perdre des oocystes et résuspendez la pastille sporozoïque à trois fois 10 à la septième oocyste par un à deux millilitres de concentration de DMEM. Pour enlever les oocystes et les coquilles restantes, placez un canon de seringue de 10 millilitres équipé d’un dispositif de support de filtre de 47 millilitres équipé d’un filtre en polycarbonate de taille pore de trois micromètres dans un tube de 15 millilitres à quatre degrés Celsius.
Ajouter 7,5 millilitres de suspension sporozoite à l’assemblage du filtre. Lorsque tout le volume est passé à travers la passoire par gravité, laver les cellules restantes à travers la passoire avec un autre 7,5 millilitres de DMEM. Lorsque tout le lavage est passé à travers la passoire, recueillir la suspension filtrée sporozoite par centrifugation pendant 10 minutes et étiqueter la pastille en 50 à 100 microlitres d’un milieu de culture organoïde approprié, complétée par 0,05% de colorant vert rapide, et L-glutathione, bétaine, L-cystéine, acide linoléique, et la taurine contenant la réduction tampon.
Pour microinjecter les parasites dans le côté apical d’un organoïde 3D, utilisez d’abord un puller micropipette pour préparer des capillaires d’injection de verre. Utilisez des forceps pour couper la pointe du capillaire à un diamètre de neuf à 12 micromètres pour permettre un flux facile de sporozoites ou d’oocystes, si vous choisissez d’injecter des oocystes directement, et utilisez des pointes de micro-chargeur pour remplir chaque capillaire d’un colorant vert rapide étiqueté oocyste ou suspension sporozoite. Ensuite, chargez le premier capillaire rempli de sporozoite dans un microinjecteur et utilisez un microscope inversé à un grossissement de 5 x et une pression constante pour microinjecter 100 à 200 nanolitres de la suspension dans chaque organoïde.
Le protocole d’excystation entraîne la libération de sporozoites d’environ 70 à 80% des oocystes. Par conséquent, il est essentiel de filtrer les coquilles oocystes restantes par une filtration de trois micromètres. Retirez près de 100 % des oocystes non glacés.
En outre, l’ajout d’un colorant vert permet d’assurer l’injection de tous les organoïdes, et permet la visualisation des organoïdes injectés pendant au moins 24 heures après l’injection. Bien qu’il s’agit d’une méthode bien pratiquée, la microscopie électronique à balayage peut être utilisée pour s’assurer que le processus d’excystation n’a pas endommagé les sporozoites ou les oocystes. L’injection de quantités égales d’oocystes dans le lumen organoïde peut être confirmée visuellement par une imagerie microscopique simple.
Les analyses d’immunofluorescence peuvent également être utilisées pour explorer les types de cellules infectées par cryptosporidium. Une fois que les organoïdes différenciés ont été infectés pendant cinq jours, la présence de sporozoites dans les oocystes peut être confirmée en séchant une partie des oocystes sur une tobody adhésive, en fixant les oocystes avec du méthanol et en combinant la coloration DAPI avec un anticorps approprié spécifique à l’oocyste. Pour obtenir un maximum de résultats, utilisez des oocystes frais, utilisez le même capillaire pour toutes les injections et changez les médias tous les jours après l’injection.
En utilisant cette technique, divers laboratoires commencent maintenant à utiliser des organoïdes pour étudier les interactions hôte-microbe. Nous étudions des proportionnels ainsi que d’autres agents pathogènes dans des milieux de microculture organoïdes similaires. Comme cryptosporidium est un parasite humain, il est important d’effectuer ces expériences selon les règlements de sécurité de niveau 2.
