이 산발성 정제 및 미세 주입 절차를 사용하여, 본질적으로 모든 호스트 미생물은 조직 유래 기관 시스템에서 공부할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 오르가노이드 루멘 또는 오르가노이드의 정압 측에 주입 된 순수 스포로조이트의 양을 제어 할 수 있습니다. C.parvum sporozoites를 정화하기 위해, 15 밀리리터 튜브로 난모세포를 옮기고 밀리리터 포비스테이션 중간 농도당 1회 10회에서 7번 의 전모세포로 세포를 재연한다.
섭씨 37도에서 60~90분 후에 는 14밀리리터의 적절한 세척 용액을 나침반과 섞고, 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다. 수퍼중의 흡기를 조심스럽게 흡인하여 스포로조이즘 펠릿을 3회 10번에서 DMEM 농도의 1~2밀리리터당 7번 의 양모로 재보종한다. 남은 난소와 껍질을 제거하려면 섭씨 4도에서 15밀리리터 튜브에 3마이크로미터 모공 크기의 폴리카보네이트 필터가 장착된 47밀리리터 필터 홀더 장치가 장착된 10밀리리터 주사기 배럴을 장착합니다.
필터 조립에 스포로조이트 서스펜션의 7.5 밀리리터를 추가합니다. 전체 부피가 중력에 의해 여과기를 통과하면, DMEM의 또 다른 7.5 밀리리터와 여과기를 통해 남은 세포를 씻어. 모든 세척이 여과 된 스포로주이트 현탁액을 원심분리로 10분 동안 수집하고 펠릿을 적절한 오르간구 배양 배지의 50~100마이크로리터로 라벨을 부착하고, 0.05%의 빠른 녹색 염료, L-글루타티온, 베타인, L-cysteine, L-cysteine, 리올레, 리놀레 산을 함유 및 함유 된 완충제.
기생충을 3D 오르간노이드의 액면에 마이크로주입하려면 먼저 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 유리 주입 모세혈관을 준비합니다. 포셉을 사용하여 모세관의 끝을 9~12 마이크로미터 직경으로 잘라 내어 스포로조이트 또는 난모의 쉬운 흐름을 가능하게 하고, 나낭을 직접 주입하기로 선택한 경우 마이크로 로더 팁을 사용하여 각 모세관을 빠른 녹색 염료 라벨또는 스포로이트 현탁액으로 채웁니다. 그런 다음, 첫 번째 산포로조이트 채워진 모세혈관을 마이크로인젝터에 적재하고 5배 배율및 일정한 압력을 사용하여 각 유기체에 서스펜션의 100~200나노리터를 마이크로젝트한다.
전이 프로토콜은 스포로조이트의 방출을 약 70~80%의 스푸사이클리스트로 이룬다. 따라서 3마이크로미터 여과를 통해 나머지 난모낭 껍질을 걸러내는 것이 필수적입니다. excysted 난모종의 거의 100 %를 제거합니다.
더욱이, 녹색 염료를 첨가하면 모든 오르가노이드의 주입을 보장하고 주입된 오르가노이드를 주입한 후 24시간 이상 시각화할 수 있다. 이것은 잘 실행된 방법이더라도, 전자 현미경 검사법은 전염 과정이 스포로조이트 또는 난모를 손상시키지 않았는지 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 오르가노이드 루멘에 동일한 양의 난모낭을 주입하면 간단한 현미경 이미징으로 시각적으로 확인할 수 있습니다.
면역 형광 분석은 또한 Cryptosporidium에 의해 감염되는 세포의 모형을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 분화 된 오르가노이드가 5 일 동안 감염된 후, 스포로조이트 내의 존재는 접착 슬라이드에 난모낭의 일부를 건조하고, 메탄올로 난낭을 고정하고, DAPI 염색을 적절한 스모시트 특이적 항체와 결합함으로써 확인할 수 있습니다. 최대 결과 위해, 신선한 난모를 사용 하 여, 모든 주사에 대 한 동일한 모세관을 사용 하 여, 주사 후 매일 미디어를 변경.
이 기술을 사용하여, 각종 실험실은 지금 호스트 세균 상호 작용을 공부하기 위하여 오르가노이드를 사용하기 시작했습니다. 우리는 유사한 오르가노이드 미세 배양 환경에서 다른 병원균뿐만 아니라 교만뿐만 아니라 다른 병원균을 연구하고 있습니다. Cryptosporidium은 인간의 기생충이기 때문에 레벨 2 안전 규정에 따라 이러한 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
