Usando este procedimento de purificação e microinjeção de sporozoita, essencialmente qualquer micróbio hospedeiro pode ser estudado em qualquer sistema de órgão derivado do tecido. Usando esta técnica, podemos controlar a quantidade de esporozoitas puros injetados no lúmen organoide ou no lado apical do organoide. Para purificar os esporozoites de C.parvum, transfira o oocisto para um tubo de 15 mililitros e resuspenque as células em uma única vez 10 a 7 vezes o oocito por concentração média de extivestação mililitro.
Após 60 a 90 minutos a 37 graus Celsius, misture 14 mililitros de uma solução de lavagem apropriada com os oócitos, e sedimente as células por centrifugação. Aspire o supernatante cuidadosamente para evitar perder oocistos e resuspensar a pelota esozoica em um três vezes 10 para o sétimo oociista por um a dois mililitros de concentração de DMEM. Para remover quaisquer oocistos e conchas restantes, coloque um barril de seringa de 10 mililitros equipado com um aparelho de suporte de filtro de 47 mililitros equipado com um filtro de policarbonato de tamanho de três micrômetros em um tubo de 15 mililitros a quatro graus Celsius.
Adicione 7,5 mililitros da suspensão do sporozoita ao conjunto do filtro. Quando todo o volume tiver passado pelo coador pela gravidade, lave todas as células restantes através do coador com outros 7,5 mililitros de DMEM. Quando toda a lavagem passar pelo filtro, colete a suspensão de sporozoita filtrada por centrifugação por 10 minutos e rotule a pelota em 50 a 100 microliters de um meio de cultura organoide apropriado, complementado com corante verde 0,05% rápido, e L-glutathione, betaine, L-cisteína, ácido linoleico e taurino contendo tampão redutor.
Para microinjetar os parasitas no lado apical de um organoide 3D, primeiro use um puxador de micropipette para preparar capilares de injeção de vidro. Use fórceps para cortar a ponta do capilar para um diâmetro de nove a 12 micrômetros para permitir um fluxo fácil de esporozoites ou oocistos, se você optar por injetar oocistos diretamente, e usar dicas de micro-carregador para encher cada capilar com um corante verde rápido rotulado oocisto ou suspensão sporozoita. Em seguida, carregue o primeiro capilar preenchido com esporozoita em um microinjetor e use um microscópio invertido a uma ampliação de 5x e uma pressão constante para microinjetar 100 a 200 nanolitros da suspensão em cada organoide.
O protocolo de excisão resulta na liberação de esporozoites de aproximadamente 70 a 80% dos oocistos. Portanto, é essencial filtrar as conchas oocistas restantes através de uma filtragem de três micrômetros. Remova quase 100% dos oocistos não excitados.
Além disso, a adição de um corante verde ajuda a garantir a injeção de todos os organoides, e permite a visualização dos organoides injetados por pelo menos 24 horas após a injeção. Embora este seja um método bem praticado, a microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para garantir que o processo de excisão não danifique os esporozoitas ou os oocistos. A injeção de quantidades iguais de oócitos no lúmen organoide pode ser confirmada visualmente por imagens microscópicas simples.
Ensaios de imunofluorescência também podem ser usados para explorar os tipos de células que são infectadas pelo Cryptosporidium. Após os organoides diferenciados terem sido infectados por cinco dias, a presença de esporozoitas dentro dos oocistos pode ser confirmada secando uma porção dos oocistos em um slide adesivo, fixando os oócitos com metanol e combinando a coloração da DAPI com um anticorpo específico para oocistos adequados. Para obter resultados máximos, use oocistos frescos, use o mesmo capilar para todas as injeções e mude a mídia todos os dias após a injeção.
Usando essa técnica, vários laboratórios estão começando a usar organoides para estudar interações hospedeira-micróbios. Estamos estudando commensais, bem como outros patógenos em configurações de microcultura organoide semelhante. Como o Cryptosporidium é um parasita humano, é importante realizar esses experimentos de acordo com as normas de segurança nível 2.
