هذه الطريقة تجعل من الممكن التلاعب وتحديد كيفية تنظيم الخلايا بشكل جماعي. وهذا أمر مهم لأننا يمكن أن نموذج نمط في المختبر وفك العظة مقرونة بإحكام في الجسم الحي. تتطلب هذه التقنية الحد الأدنى من المعدات المتخصصة ، مما يسمح بإرساءها في مختبر بيولوجي قياسي ، وهي كمية ، مما يجعل من الممكن اكتشاف أحداث النقش شبه البصرية.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أي نظام خلية حيث يمكن أن تظهر النقش واكتشاف أنماط غير عشوائية من التمايز، والانتشار، وتنافس الخلايا إلى الخلية. الرئيسي مع هذا الأسلوب هو التحسين المنهجي لالمعلمات micropatterning لأنواع الخلايا الجديدة. على سبيل المثال، حجم النقش وشكله ونوع المصفوفة ووقت التصاق الخلية.
ارتداء قفازات، ووضع قطعة من الفيلم المختبر في الجزء السفلي من طبق بيتري مربع 10 سنتيمترات. استخدام لكمة حفرة 12 ملليمتر لقطع الشرائح البلاستيكية المائية لإنشاء 12 ملليمتر حول زلات الغطاء، ووضع زلات الغطاء في طبق بيتري جديد. استخدم الملاقط لإزالة الفيلم الواقي بعناية من زلات الغلاف.
ضع قناع الصورة على سطح نظيف ومستقر ، وجانب الكروم لأعلى ، وأضف قطرة من الماء المقطر المزدوج في موضع تصميم الشريحة المطلوبة. اضغط بلطف على زلة غلاف على القطرة ووضع حاملها على رأس الشرائح البلاستيكية. إصلاح بعناية هذا ساندويتش مع المشابك للحفاظ على القطع البلاستيكية في اتصال مع قناع الصورة.
ضع التجميع في مصباح أوزون فوق البنفسجية حوالي سنتيمترين من مصدر الضوء لإضاءة لمدة 10 دقائق. في نهاية فترة الإضاءة، فهم شطيرة مع قناع الصورة في الجزء السفلي وإزالة المشابك بعناية مع الحفاظ على الضغط بيد واحدة لمنع الشرائح من التحرك في حين تفكيك شطيرة. عندما تم إزالة جميع المشابك، وإزالة حامل، مع الحرص على أن جميع القطع البلاستيكية لا تزال على القناع وغير عالقة إلى حامل، وإضافة الماء المقطر المزدوج إلى رقائق لفصل بلطف رقائق من قناع الصورة.
ضع الرقائق المنقوشة على الصورة داخل غرفة الترسب المصفوفية ، الجانب المضاء ، وأضف 200 ميكرولترات من محلول الطلاء على كل رقاقة. ثم، إضافة طبق بيتري ثلاثة سنتيمترات مليئة بالماء المقطر المزدوج إلى الغرفة للحد من التبخر في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لزرع الخلايا الجنينية على رقائق، وغسل رقائق مع اثنين من يغسل ما لا يقل عن خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة والمعقمة لكل غسل، قبل الاستغناء عن واحد مرة عشرة إلى الخلايا الخامسة في 200 ميكرولترات من متوسطة ثقافة الخلية المناسبة على كل رقاقة.
ثم أغلق غرفة البذر. احتضان لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا على التمسك رقائق. عندما تعلق الخلايا، ملء آبار لوحة متعددة الآبار مع 500 ميكرولترات من المتوسطة الدافئة في البئر، واستخدام ملاقط عقيمة لنقل رقائق في آبار لوحة الفردية.
يهز لوحة بقوة لفصل أي خلايا غير المنضمة، وعلى الفور استبدال ناظر مع الطازجة، المتوسطة الدافئة. ثم تحقق تحت المجهر لمراقبة ما إذا كان النقش مرئيًا أم لا. بعد 48 ساعة من الطلاء، يجب أن تشكل الخلايا مستعمرات كثيفة تتبع بدقة شكل الأنماط.
ترك رقائق في لوحة، وإزالة جميع ولكن فقط ما يكفي من المتوسطة لمنع رقائق من التجفيف، وإضافة ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من paraformaldehyde أو محلول التثبيت القائم على PFA في بئر. بعد عشر دقائق، وغسل الآبار لفترة وجيزة ثلاث مرات مع محلول الغسيل، تليها غسل واحد مع كلوريد الأمونيوم 50 ملليمولر المخفف في محلول الغسيل لإخماد المتبقية PFA عبر النشاط. بعد الغسيل الأخير، تعاملي مع العينات بمحلول مانع لمدة 30 دقيقة على الأقل.
للمناعة من الثقافات رقاقة، نقل رقائق في الجانب خلية غرفة تلطيخ حتى، وعلى الفور إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الأولية التي تهم كل رقاقة. بعد ساعة واحدة على منصة دوارة في درجة حرارة الغرفة، وغسل رقائق ثلاث مرات مع محلول الغسيل كما هو موضح، واحتضان رقائق مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة على منصة الدورية. في نهاية حضانة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل رقائق ثلاث مرات في محلول الغسيل وجبل رقاقة على شريحة المجهرية مع 20 ميكرولترات من أي متوسطة تصاعد القياسية.
لصورة الرقائق، أولاً ضبط سرعة المسح الضوئي، ودقة الصورة، ومتوسط الإطار، ومكاسب الكاشف لتحديد أفضل ما بين جودة الصورة ووقت التصوير. ثم الحصول على صور لكل رقاقة. عند الحصول على كافة الصور، تثبيت وتشغيل PickCells التالية الوثائق المتوفرة على الإنترنت، إنشاء تجربة جديدة، واستيراد الصور إلى البرنامج.
استخدم وحدة نيسيز لتقسيم النوى استنادًا إلى إشارة المغلف النووي. استخدم الوحدة النمطية الأساسية للتجزئة لتحديد إشارة النقش التلقائي. ثم انقر فوق إنهاء "وانتظر حتى تتم معالجة كافة الصور.
لإنشاء كائنات نواة وحوسبة ميزات الكائن الأساسية، قم بتشغيل وحدة الميزات الجوهرية من شريط المهام وإغلاق لوحات المجهز الإهليلجي وسطح النازع للحفاظ على لوحة الميزات الأساسية مفتوحة فقط. حدد النواة "كنوع الكائن، وحدد البادئة المقدمة التي تم تحديدها للصور المجزأة. ثم انقر فوق Compute "وانتظر حتى تتم معالجة كافة الصور.
في هذه المرحلة، يجب كتابة ميزات إضافية في النوى قبل تصدير البيانات لتحليلنا. على سبيل المثال، لتخزين اسم الصورة التي تنتمي إليها كل نواة كسمة Nucleus، انقر فوق البيانات"والسمة الجديدة" وحدد النواة"في الحوار المنبثق. انقر فوق موافق "حدد جمع البيانات من الكائنات الأخرى المتصلة العقدة" وانقر فوق التالي "في اللوحة اليمنى، حدد صورة" وانقر نقراً مزدوجاً فوق علامة الاستجواب لتعيين عقدة الصورة كهدف للمسار.
قم بتوسيع جزء عملية التخفيض وحدد الحصول على واحد"توسيع جزء السمة المتوفرة وحدد السمة الاسم. ثم انقر فوق تغيير"و التالي"أدخل اسم الصورة، اضغط على المفتاح Tab، وانقر فوق إنهاء"ثم تصدير البيانات إلى ملف قيمة مفصولة بعلامة التبويب. لتحليلنا، حلقة البيانات التي تم تصديرها إلى مجلد البيانات من المجلد R-النصي.
فتح لدينا استوديو "وفتح قالب خريطة binned R-Script"ثم تعيين دليل العمل إلى موقع الملف المصدر، وتشغيل البرنامج النصي لتوليد خرائط الكثافة. في ساعة واحدة بعد زرع الخلايا، قد لا تكون الخلايا الفردية الزنكة تماما كما تتكاثر الخلايا مع مرور الوقت. ومع ذلك، سوف تصبح أنماط المستعمر بالكامل مع عدد قليل جدا من الخلايا فقط خارج الأسطح اللاصقة.
النقش الذي ليس واضحا ما يصل الى ساعتين بعد البذر يشير إلى فشل الإجراء. إن الحبس المكاني للخلايا الجذعية الجنينية الماوس على أقراص كبيرة أو رنين صغير حلقة يوجه نمط مجموعة فرعية من الخلايا التي تعبر عن علامة brachyury mesodermal. على سبيل المثال، عندما تزرع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس على ميكروباتينس القرص الكبير، تكون الخلايا الإيجابية brachyury مقيدة بشكل تفضيلي إلى محيط النمط حيث كثافة الخلايا المحلية هي الأدنى.
ويؤكد هذا النقش من خلال خريطة كثافة الدماغ brachyury. وتبين هذه البيانات أن الأسلوب يمكن أن تكشف عن المعلومات دون البصرية كما التفتيش من مستعمرة واحدة ليست كافية لتحديد أي شكل من أشكال التنظيم المكاني في علامة التعبير عن الفائدة. ويفسر هذا بشكل ملحوظ من قبل اختلاف مستعمرة إلى مستعمرة هامة.
وتبين هذه التقنية أيضا أنه لا يوجد أي نمط يمكن اكتشافه لمثبطات من الحمض النووي ملزمة واحدة والتي قد تشير إلى أن T-نقش لا تحركها العظام الإشارات البروتين المورفوجينيك في هذا السياق. تذكر دائما أي جانب من زلة الغطاء قد تم القضاء عليها ومغلفة وأيضا التأكد من أن الخلايا قد التزمت بشكل صحيح قبل غسل الخلايا الزائدة. هذه الطريقة تسمح لدراسة الإشارات البيئية الهامة في توجيه التنظيم الذاتي للخلايا ويمكن أيضا أن أبلغ النماذج الرياضية التي تساعدنا على نحو أفضل في ظل النقش البدائية.
