この方法により、細胞の集合体の整理方法を操作し、定量化することができます。インビトロでパターンをモデル化し、インビボでしっかりと結合されたキューをディゼンターグルすることができるので、これは重要です。この技術は最小限の専門機器を必要とし、標準的な生物学ラボで確立することができ、定量的であり、サブビジュアルパターンイベントの発見を可能にする。
この方法は、パターニングが出現する可能性のある細胞システムに簡単に適用でき、分化、増殖、および細胞間競争の非ランダムパターンを発見することができます。この方法の主な方法は、新しい細胞タイプのマイクロパターン化パラメータの体系的な最適化です。たとえば、パターンのサイズと形状、マトリックスの種類、セル接着時間などです。
手袋を着用し、10センチメートルの正方形のペトリ皿の底に実験室のフィルムを置きます。12ミリメートルの穴パンチを使用して疎水性プラスチックスライドをカットして12ミリメートルのカバースリップを作成し、カバースリップを新しいペトリ皿に入れます。ピンセットを使用してカバースリップから保護フィルムを慎重に取り除きます。
フォトマスクを清潔で安定した表面に置き、クロム側を上に置き、目的のチップ設計の位置に2マイクロリットルの二重蒸留水を追加します。カバースリップをドロップにそっと押し込み、ホルダーをプラスチックスライドの上に置きます。このサンドイッチを慎重にクランプで固定し、フォトマスクに接触するプラスチック片を維持します。
光源から約2センチメートル離れた紫外オゾンランプにアセンブリを配置し、10分間の照明を行います。照明期間の終わりに、下部にフォトマスクを持つサンドイッチをつかみ、慎重に片手で圧力を維持しながらクランプを取り外し、サンドイッチを分解しながらスライドが動き回るのを防ぎます。すべてのクランプが取り外されたら、ホルダーを取り外し、すべてのプラスチック片がまだマスク上にあり、ホルダーに貼り付けられていないように注意し、チップに二重蒸留水を加えて、フォトマスクからチップを静かに取り外します。
フォトパターンチップをマトリックス堆積チャンバー内に配置し、側面を上に照らし、各チップに200マイクロリットルのコーティング溶液を追加します。その後、二重蒸留水で満たされた3センチメートルのペトリ皿をチャンバーに加え、一晩で摂氏4度で蒸発を制限します。チップに胚細胞を播種する場合は、各チップに適切な細胞培養培地の200マイクロリットルで10〜5番目の細胞を10回分配する前に、洗浄ごとに少なくとも5分間の洗浄でチップを洗浄します。
その後、シーディングチャンバーを閉じます。細胞がチップに付着できるように1時間インキュベートする。細胞が付着したら、マルチウェルプレートのウェルに1ウェルあたり500マイクロリットルの暖かい媒体を充填し、滅菌ピンセットを使用してチップを個々のプレートウェルに移します。
プレートを激しく振って非接着細胞を取り外し、すぐに上清を新鮮で暖かい媒体に置き換えます。次に顕微鏡の下で、パターニングが見えるかどうかを確認します。めっきの48時間後、細胞はパターンの形状に厳密に従う密なコロニーを形成するべきである。
チップをプレートに残し、チップの乾燥を防ぐのに十分な培地以外のすべてを取り除き、ウェルあたり少なくとも500マイクロリットルのパラホルムアルデヒドまたはPFAベースの固定溶液を追加します。10分後、ウェルを洗浄液で3回短時間洗浄し、続いて50ミリモルの塩化アンモニウムを洗浄液で希釈して残留PFA架橋活性を消し止める1回洗浄を行った。最後の洗浄後、ブロッキング溶液でサンプルを30分以上処理します。
チップ培養の免疫染色のために、チップを染色チャンバーのセル側に上に移し、関心のある一次抗体溶液の100マイクロリットルを各チップに直ちに添加する。室温で回転プラットフォームで1時間後、示されているように洗浄液でチップを3回洗浄し、回転プラットフォーム上で1時間適切な二次抗体でチップをインキュベートします。二次抗体インキュベーションの最後に、洗浄液でチップを3回洗浄し、標準的な取り付け媒体の20マイクロリットルを用いた顕微鏡スライドにチップを取り付けます。
チップを画像化するには、まずスキャン速度、画像解像度、フレーム平均、検出器のゲインを調整して、画質とイメージング時間の最適値を特定します。その後、各チップの画像を取得します。すべてのイメージが取得されたら、オンラインで入手可能なドキュメントに従って PickCells をインストールして実行し、新しい実験を作成し、イメージをプログラムにインポートします。
Nessys モジュールを使用して、核エンベロープ信号に基づいて核をセグメント化します。基本セグメンテーションモジュールを使用して、パターンの自己蛍光信号を特定します。次に[完了]をクリックし、すべての画像が処理されるのを待ちます。
核オブジェクトを作成し、基本的なオブジェクト機能を計算するには、タスクバーから組み込みフィーチャーモジュールを起動し、楕円体フィッターパネルとサーフェス抽出パネルを閉じて、[基本機能]パネルのみを開いたままにします。オブジェクトタイプとして「nucleus」を選択し、セグメント化された画像に指定された接頭辞を選択します。次に[計算]をクリックし、すべての画像が処理されるのを待ちます。
この段階では、分析のためにデータをエクスポートする前に、追加のフィーチャを核に書き込む必要があります。たとえば、各核が属するイメージの名前を核属性として保存するには、「データ」と「新しい属性」をクリックし、ポップアップダイアログで「nucleus」を選択します。「OK」をクリックして、ノードに接続されている他のオブジェクトからデータを収集」を選択し、「次へ」をクリックして、左パネルで、画像を選択し、画像ノードをパスのターゲットとして設定する尋問マークをダブルクリックします。
[縮小操作] ウィンドウを展開し、[1 つを取得] を選択します" [使用可能な属性] ウィンドウを展開し、[名前] 属性を選択します。次に、[変更]をクリックし、[次へ]画像名を入力し、Tabキーを押して[完了]をクリックし、次に、データをタブ区切り値ファイルにエクスポートします。分析のために、R-Script フォルダのデータ フォルダにエクスポートされたデータをループします。
「私たちのスタジオ」を開き、ビン分割されたマップテンプレートR-Script"を開き、作業ディレクトリをソースファイルの場所に設定し、密度マップを生成するためにスクリプトを実行します。細胞播種後1時間で、細胞が時間の経過とともに増殖するにつれて、個々の細胞培養パテンが完全にコンフルエントでない場合があります。しかし、パターンは接着面の外側に非常に少数の細胞で完全に植民地化されます。
シード処理の 2 時間後までクリアされないパターンは、手順の失敗を示します。大きなディスクまたはリングマイクロパターン上のマウス胚性幹細胞の空間的閉じ込めは、中胚マーカーを発現する細胞のサブ集団のパターニングを導く。例えば、マウス胚性幹細胞が大ディスクマイクロパターン上で増殖する場合、小頭陽性細胞は局所細胞密度が最も低いパターンの周辺に優先的に制限される。
このパターニングは、脳と強さのマップによって確認されます。これらのデータは、1つのコロニーの検査が関心マーカー式の空間組織の任意の形態を識別するのに十分ではないとして、この方法がサブ視覚情報を明らかにできることを示している。これは、重要なコロニー間変動によって特に説明される。
この技術はまた、Tパターニングがこの文脈で骨形態形成タンパク質シグナル伝達によって駆動されないことを示す可能性のあるDNA結合の阻害剤に対して検出可能なパターニングが存在しないことを示している。カバースリップのどの側が排除され、コーティングされているかを常に覚えておき、余分な細胞を洗い流す前に細胞が適切に付着していることを確認してください。この方法は、細胞の自己組織化を導く上で重要な環境の手掛かりの研究を可能にし、また、基本的なパターン形成の下で私たちをより良く助ける数学的モデルを知らせることができます。
