وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كولتر، ومؤسسة بايستر، فرصة البحوث الجامعية (UROP) البرنامج الصيفي لATA وطلاب الدراسات العليا العلوم الوطنية زمالة مؤسسة البحوث (منحة لا DGE 0718128؛ ID: 2010101926) لJBW.

1. المرحلة توصيف النظام: تحديد عتبات للفصل المرحلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محاليل تحتوي على PEG وDEX في المخزن المؤقت المطلوب أو خلية ثقافة المتوسط ​​كما هو موضح في الشكل 1 (النقاط البنفسجية) في 15 مل أو 50 مل المخروطية أنابيب. الآخرة، وسوف PEG وDEX الرجوع إلى PEG كيلو دالتون 35 و 500 كيلو دالتون DEX، ومع ذلك، سوف تتغير تركيزات الحرجة اعتمادا على البوليمرات اللتين استخدمتا. تسجيل كتلة PEG وDEX في كل حل. قد عالية التركيز حلول البوليمر يستغرق عدة ساعات ليذوب. ويمكن استخدام المصل لVortexing خالية الحلول. وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتينات أو مصل، ضع الأنابيب في مرحلة تعصف حتى يتم حل كل البوليمرات بشكل كامل. سجل وزن وسائل الإعلام المستخدمة لإذابة البوليمرات وتحيط علما تركيزات الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم حل الكامل للبوليمرات، ينبغي أن تظهر حلول غائم. هذا هو أول إشارة إلى أن فصل المرحلة حدث. لتأكيد هذا، والسماح للالبوليمر حلول للراحة في وضع عمودي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ويمكن استخدام الطرد المركزي في 1000 x ج لتسريع عملية فصل المرحلة. سوف يكون أكثر كثافة مرحلة القاع DEX الغنية والمرحلة الأعلى سيكون PEG الغنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ببطء عازلة إضافية أو وسائل الإعلام إلى الأنابيب. وينبغي أن تستخدم زيادات صغيرة حتى لا يقفز نقطة فصل المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يصبح واضحا الحل لم يعد والتخلص يفصل بعد الطرد المركزي، تم الوصول إلى عتبة مرحلة الانفصال. تسجيل الوزن النهائي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأوزان السابقة المسجلة للبوليمرات، جنبا إلى جنب مع الوزن النهائي بعد إضافة وسائل الإعلام، وتحديد وزن٪ / وزن كل البوليمرات التي اثنين من فصل المرحلة لن يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم هذه القيم كما PEG WT / WT٪ على DEX WT / WT المحور ص و٪ على المحور س. ويمكن استخدام هذه المؤامرة، والمعروفة باسم منحنى binodal، لتحديد عتبة التركيز لفصل المرحلة لconcentrati مختلفةإضافات من PEG / DEX في وسط الخلية ثقافة محددة. </li></ol> 2. التكوين 1: زخرفة استبعاد (96 لوحة جيدا تنسيق) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول منفصلة من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية. ATPS استخدام الحلول من وجهة نظر على الأقل مرتين الحرجة لضمان أن يظل ATPS بعد البوليمرات تتوازن مع الاحترام لبعضهما البعض. هناك كمية صغيرة من تدفق DEX في المرحلة PEG الغنية والعكس بالعكس، لذلك، والعمل أيضا بالقرب من تركيز الحرجة يمكن أن يؤدي إلى فقدان النظام وانخفاض تركيزات المرحلة أدناه نقطة حرجة. وبالمثل، يمكن نقل الطبق الثقافة الخلية الحاضنة إلى الرطوبة ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها تغيير خصائص مرحلتين وجعل الحلين غير قابلة للامتزاج. ملاحظة: بعض الخلايا قد تؤدي بشكل أفضل مع تركيبات ATPS أخرى. ويمكن اختيار الصيغ مقبولة على أساس منحنيات binodal تحديدها من الجزء 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا لاستخدامها في patte الاستبعادrning. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة. اختياري: تسمية الخلايا مع CellTracker أو غيرها من التسميات غير السامة للخلايا للفحص المجهري مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا و resuspend بيليه في حجم مناسب من 5.0٪ الوتد لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا للاستبعاد. على سبيل المثال، واحدة من لوحة جيدا 96-جيدا يتطلب أن يكون معلق الخلايا الليفية 37500 في 200 ميكرولتر من PEG لإنتاج التقاء في اليوم التالي. توسيع نطاق هذه الأرقام بما يتناسب مع أنواع الخلايا الأخرى والأحجام الركيزة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. قطرات أكبر حجم إنتاج أكبر مناطق الاستبعاد. ويوصى قطرات تتراوح في حجمها 0،1 حتي 1 ميكرولتر لmicropatterning الاستبعاد. اختياري: يمكن إيداع قطرات DEX 24 ساعة قبل الموعد المحدد ويسمح لليذوى في درجة حرارة الغرفة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 ميكرولتر من الاستغناء تعليق الخلية إلى PEG روأشار إلى أن تغطية قطرات DEX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلية في منطقة الحظر. </li></ol> 3. التكوين 2: زخرفة جزيرة (96 لوحة جيدا تنسيق) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه و resuspend الخلايا في وحدة تخزين مناسبة من DEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا لتنميط الجزيرة. تركيزات من 5،000 مويوصى LLS / ميكرولتر أو أقل لأنواع الخلايا الملتصقة بقوة. قد لاعتبار الخلايا التي يجدون صعوبة في إرفاق أو الخلايا التي تلتزم فضفاضة، تركيزات تصل إلى 10،000 خلية / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة لتجنب التجفيف، ماصة قطرات 0،5 ميكرولتر من DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة، كما هو موضح أعلاه. لا تسمح قطرات لتجف. اختياري: يمكن إضافة 200 ميكرولتر من محلول PEG إلى البئر في وقت مبكر. ويمكن بعد ذلك قطرات DEX تودع في حل PEG حيث أنها سوف تنزل الى القاع والاتصال سطح الثقافة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف الجزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ثقافة جديدةالمتوسطة والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلايا وانتشار الخارج من الجزر. </li></ol> 4. تكوين 3: استبعاد المشارك الثقافات (96 لوحة جيدا تنسيق) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الإقصاء والجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتوفرة لكل نوع من الخلايا. اختياري: بعض أزواج الخلية قد يعرض مؤشرات انتشار مختلفة بشكل كبير. لمنع خلايا استبعادها من overpopulating على نمط الخلايا الجزيرة (وخاصة بالنسبة للثقافات على المدى الطويل)، وعلاج الخلايا المستخدمة لاستبعاد مع C لمدة 2 ساعة ميتوميسين أو أشرق لهم قبل الحصاد. وهذا منع الانتشار. ويمكن استخدام الأصباغ الفلورية CellTracker للتمييز بين السكان اثنين من خلية إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا و resuspend بيليه لexclusioن الزخرفة في حجم مناسب لPEG 5.0٪ لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق بيليه لجزيرة الزخرفة في حجم مناسب لDEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات التعليق الخلية DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. لا تسمح قطرات لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد شارك في الثقافات لمراقبة التفاعل بين السكان الخلية. يمكن إعداد الضوابط قبل تنفيذ استبعاد أو فردي الجزيرة الزخرفة: اختياريidually، من خلال المشاركة في الثقافة الخلايا التي لا تتفاعل أو عن طريق منع المسارات التاريخية في السكان خلية واحدة أو كليهما قبل أو بعد الزخرفة. </li></ol>

<ol>
	<li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems+:+methods+and+protocols.">Aqueous two-phase systems : methods and protocols.</a> Methods in biotechnology. xiii, 440 (2000).</li><li>Albertsson, P. A. k. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. , 346 (1986).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+partitioning+using+an+aqueous+two-phase+flow+system+in+microfluidic+devices.">Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices.</a> Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).</li><li>Soohoo, J. R., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+aqueous+two+phase+system+for+leukocyte+concentration+from+whole+blood.">Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood.</a> Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).</li><li>Hahn, T., Hardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+size+separation+of+DNA+samples+at+liquid-liquid+interfaces.">Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces.</a> Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).</li><li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems.+A+general+overview.">Aqueous two-phase systems. A general overview.</a> Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).</li><li>Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+recovery+using+two-phase+systems.">Protein recovery using two-phase systems.</a> Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).</li><li>Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Phase+Separation+as+a+Possible+Route+to+Compartmentalization+of+Biological+Molecules.">Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules.</a> Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).</li><li>Helfrich, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+assembly+of+metal+particles+and+their+bioconjugates+in+aqueous+two-phase+systems.">Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems.</a> Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).</li><li>Diamond, A. D., Hsu, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prote.+Partitioning+in+PEG/Dextran+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems.</a> AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).</li><li>Y-T, Z. -. Q., Zhu, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+interfacial+tension+of+aqueous+two-phase+systems.">Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems.</a> Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).</li><li>Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+dependence+of+the+interfacial+tension+for+aqueous+two-phase+polymer+solutions+of+dextran+and+polyethylene+glycol.">Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol.</a> Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).</li><li>Rha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+of+Polyethylene+Glycol/Potassium+Phosphate+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems.</a> Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Generation+of+Multiplexed+Cell+Cocultures+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Followed+by+Aqueous+Two-Phase+Exclusion+Patterning.">Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning.</a> Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. , (2011).</li><li>Tavana, H., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+biphasic+microprinting+approach+to+tissue+engineering.">Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 13404 (2011).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+targeted+delivery+of+cells+and+biomolecules+within+microchannels+using+aqueous+two-phase+systems.">Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems.</a> Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).</li><li>Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+of+Polymeric,+Aqueous,+Biphasic+System+Facilitates+High+Throughput+Cell+Exclusion+Patterning+for+Cell+Migration+Studies.">Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).</li><li>Falconnet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays.">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li><li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensing+and+response+to+micro-+and+nanostructured+surfaces+produced+by+chemical+and+topographic+patterning.">Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning.</a> Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li><li>Ringeisen, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-based+methods+to+print+living+cells.">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).</li><li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+co-cultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).</li><li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks.">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li><li>Berthier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipette-friendly+laminar+flow+patterning+for+cell-based+assays.">Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).</li><li>Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-induced+mammalian+cell+hybridization:+effect+of+polyethylene+glycol+molecular+weight+and+concentration.">Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration.</a> Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).</li><li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement.">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).</li><li>Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Title+Cell+Encapsulation+by+Droplets.">Title Cell Encapsulation by Droplets.</a> J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).</li></ol>

والكتاب لا تتنافس المصالح المالية.

وmicropatterning الخلية ATPS الأسلوب يتطلب القليل جدا من الخبرة وراء الكفاءة في تقنيات زراعة الخلايا ويمكن أن يتقن بسرعة. مزايا هذا النهج هي أن أنها غير مكلفة وسريعة ومتوافقة مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وصيغ الثقافة. لهذه الأسباب، ينبغي لنا اعتمد بروتوكول بسهولة من قبل ...

مائي على مرحلتين نظم (ATPSs) شكل عند خلط الحلول اثنين من البوليمرات غير متوافقة معا في تركيزات عالية بما فيه الكفاية. ويتأثر فصل المرحلة عن طريق مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل الوزن الجزيئي وقطبية من البوليمرات، ودرجة الحرارة من درجة الحموضة والحلول والمحتوى الأيونية من المذيب المائي 1 و 2. النقطة التي يتم تحديد حلين البوليمر منفصلة من الخصائص الفيزيوكيميائية لنظام اختيار المرحلة، ولكن يحدث عادة على تركيزات منخفضة البوليمر (أقل من 20٪ بالوزن / WT) في ظل ظروف غير يبدل طبيعة، السماح باستخدام التكنولوجيا الحيوية لATPSs تطبيقات 3-9. حتى الآن على نطاق واسع الأكثر دراسة ATPS هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) / ديكستران النظام (DEX). وقد وصفت في الأصل ATPS التي شكلتها هذه البوليمرات غير مكلفة وحيويا لتنقية الجزيئات الحيوية عن طريق تقسيم الجزيئية 2 و 10. تقسيميحدث عند خلط جزيئات إضافية أو الجزيئات التي لا تساهم في النظام مع المرحلة PEG وDEX. على أساس الانتماءات النسبية لأي DEX أو PEG، فإن الجزيئات أو الجسيمات الموجودة تفضيلي ضمن واحدة من المرحلتين أو في الواجهة. خاصية أخرى من ATPS PEG / DEX هو وجود التوتر السطحي بين مراحل البوليمر اثنين. ATPSs التي شكلتها PEG وDEX عرض التوترات عموما بينية التي هي أقل بكثير من غيرها من نظم على مرحلتين بين السوائل مثل النفط والمياه، إلا أن القوات لا تزال تمارس التوتر السطحي على آثار جزيئات صغيرة مثل الفيروسات والخلايا والمجاميع البروتين 2 ، 11-13. وأخيرا، منذ ارتفاع الوزن الجزيئي وPEG DEX منفصلة في تركيزات منخفضة (أقل من 5٪ بالوزن / WT عالية الوزن الجزيئي البوليمرات أصناف) في وجود تركيزات الفسيولوجية للأملاح، هناك عدد قليل إذا أي آثار ضارة على خلايا الثدييات أدرجت ضمن هذه نظم14-16. مؤخرا، تم تطبيق خصائص وتأثيرات بينية من تقسيم ATPSs من مختبرنا للتنميط خلية 14، 16-20. وتم ذلك عن طريق حل micropatterning DEX أكثر كثافة على ركائز ثقافة الخلية في وجود PEG. عندما تدمج الخلايا في مرحلة PEG، فهن مستبعدات من دخول قطرات DEX بسبب PEG / DEX التوتر السطحي 20. عندما يتم منقوشة الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر، يتم الاحتفاظ بها على سطح الخلية الركيزة الثقافة عن طريق تقسيم التوتر السطحي و16، 17، 19. وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لخلية الزخرفة، الزخرفة ATPS خلية من السهل تعلم، ويتطلب فقط معرفة أولية حول البوليمرات أنفسهم، والقدرة على أداء زراعة الخلايا واستخدام micropipettor. أساليب أخرى للتنميط الخلية غالبا ما تنطوي على المعدات المتخصصة والتدريب التي لا تترجم بسهولة إلى اله علوم الحياة. على سبيل المثال، بعض الطرق (microcontact الطباعة النافثة للحبر الطباعة أو) الخلايا بشكل غير مباشر من خلال تطبيق نمط أنماط الجزيئات الحيوية لاصقة خلية إلى الركيزة التي تخدم الثقافة فيما بعد مواقع لمرفق الخلية 21 و 22. على الرغم من النهج غير المباشرة مفيدة لبعض أنواع الخلايا، فإنها تتطلب درجة عالية من المهارة المستخدم والمعدات المتخصصة لصنع أداة الزخرفة، ويمكن أن تفتقر خصوصية تبعا لنمط معين نوع / جزيء حيوي الخلية. بدلا من ذلك، يتم إيداع الخلايا مع خصوصية عالية عن طريق نمط من النهج الزخرفة المباشرة التي تشمل تدفق الصفحي الزخرفة، الطباعة بالستينسيل والطباعة النافثة للحبر 23-26. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تتطلب أيضا خبرة المستخدم والمعدات المتخصصة، ويمكن أن يتلف الخلايا أثناء عملية الطباعة. على الرغم من أن هذه المناهج عموما إنتاج أنماط دقيقة من الخلايا، على سبيل الزخرفة الخلية إلى أن تكون أداة مفيدة في علوم الحياة، يجب أن يكون فعالة من حيث التكلفة لبسيطة لتنفيذ الثانية. نحن هنا تقرير مفصل بروتوكول لتوليد نمط مزارع الخلايا باستخدام ATPSs وصفها في تطبيقاتنا التي صدرت سابقا. باستخدام micropipettors فقط، يمكن للمستخدمين إنشاء مناطق الحظر الخلية أو الخلايا الجزر لفحوصات الهجرة. ويتحقق هذا عن طريق PEG / DEX التوتر السطحي أن يحتفظ إما الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر أو يستثني الخلايا المودعة في المرحلة PEG من DEX. من هذه تمشيط اثنين من التقنيات الأساسية الزخرفة، فمن الممكن لتوليد بسرعة شارك في الثقافات من الخلايا مثل الخلايا الليفية الخلايا الكبد شارك في الثقافات. أساليب الزخرفة وصفها، ATPS المعلمات والنتائج المتوقعة بالتفصيل.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> الصانع </td></tr><tr><td> ديكستران 500،000 كيلو دالتون </td><td> Pharmacosmos، الدنمارك </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول 35000 كيلو دالتون </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td></tr><tr><td> الحله </td><td> ATCC، ماناساس، VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC، ماناساس، VA </td></tr><tr><td> 3T3 المعاهد الوطنية للصحة </td><td> ATCC، ماناساس، VA </td></tr><tr><td> خلية المقتفي </td><td> إينفيتروجن، كارلسباد، CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco، كارلسباد، CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco، كارلسباد، CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco، كارلسباد، CA </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco، كارلسباد، CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

سوف تكون هناك حاجة التكنولوجيات الزخرفة الخلية التي هي سريعة وسهلة الاستخدام وبأسعار معقولة للتنمية المستقبلية للفحوصات عالية الإنتاجية الخلية، ومنصات لدراسة الخلية خلايا الأنسجة التفاعلات ونظم الهندسة. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد المشترك الثقافات من الخلايا باستخدام حلول حيويا من ديكستران (DEX) والبولي اثيلين جليكول (PEG) أن التخلص منفصلة عند دمجها أعلاه تركيزات العتبة. ويمكن نمط الخلايا في مجموعة متنوعة من التشكيلات باستخدام هذا الأسلوب. لا يمكن أن يؤديها الخلية الزخرفة الاستبعاد عن طريق طباعة قطرات من DEX على ركيزة وتغطيتها بمحلول مكون من خلايا تحتوي على PEG. التوتر السطحي شكلت بين حلول البوليمر سببين الخلايا في الانخفاض في جميع أنحاء خارج الحبرية DEX وتشكيل المقاصة دائرية التي يمكن استخدامها لفحوصات الهجرة. يمكن منقوشة جزر خلية الاستغناء مرحلة DEX الخلية الغنية في حل PEG أو من خلال تغطية DEXالقطرة بمحلول مكون من PEG. يمكن أن تتكون شارك في الثقافات مباشرة من خلال الجمع بين الخلايا مع استبعاد الزخرفة الجزيرة DEX. هذه الأساليب متوافقة مع مجموعة متنوعة من النهج التعامل مع السائل، بما في ذلك micropipetting دليل، ويمكن استخدامها مع أي نوع من الخلايا تقريبا ملتصقة.

لتحديد توليفة مناسبة من PEG والزخرفة DEX لخلية من المهم لتحديد منحنى binodal. هذا المنحنى يحدد النقاط التي يمكن أن تشكل على ATPS ويمكن أن تختلف لمجموعة معينة من البوليمرات على أساس درجة الحموضة، ودرجة الحرارة والمحتوى الأيونية. زراعة للخلايا التي تتطلب تركيبات مخصصة المتوسط...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems at JoVE.com

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

واستخدمت مائي مرحلتين نظم للسكان في وقت واحد نمط متعددة من الخلايا. هذه طريقة سريعة وسهلة للخلية الزخرفة يستفيد من فصل مرحلة من المحاليل المائية للجلايكول والبولي ايثيلين ديكستران والتوتر السطحي القائمة بين حلول البوليمر اثنين.

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Views.  University of Michigan. واستخدمت مائي مرحلتين نظم للسكان في وقت واحد نمط متعددة من الخلايا. هذه طريقة سريعة وسهلة للخلية الزخرفة يستفيد من فصل مرحلة من المحاليل المائية للجلايكول والبولي ايثيلين ديكستران والتوتر السطحي القائمة بين حلول البوليمر اثنين.

Video: Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

بسيطة، بأسعار معقولة، ونمط وحدات من الخلايا باستخدام الحمض النووي

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...