هذا في الوقت الحقيقي RT-PCR مناسبة لتشخيص داء الكلب بسرعة في عينات ما قبل الوفاة وما بعد الوفاة. تم تحسين التمهيديات Pan-Lyssavirus لتحديد جميع أعضاء جنس فيروس ليسا. هذا هو سريع, حساسة, ومغلقة أنبوب الفحص الذي يكشف الفيروسات من جميع أنحاء جنس فيروس ليسا بما في ذلك الأنواع المتباينة للغاية من العينات السريرية.
وقد قبلت OIE مؤخرا المقايسات الجزيئية للإبلاغ عن عدوى داء الكلب. وهذا أمر مهم بشكل خاص للعينات المتحللة التي لا يمكن تشخيصها دائمًا بواسطة ثقافة الفيروسات أو طرق اكتشاف المستضد. ونظرا لحساسية هذا الفحص، فإن الممارسة المختبرية الجيدة، بما في ذلك الفصل بين المراحل المختلفة، أمر حيوي للتقليل من خطر التلوث.
إثبات الإجراء سيكون ديزي جينينغز، طبيبة تشخيصية من مختبري. ابدأ بتحديد الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيفي صغير الحجم. تأكد من تعيين الجهاز إلى الجيش الملكي النيبالي واستخدام واحد إلى اثنين microliters من المياه الصف الجزيئي لتطبيع الجهاز ووضع خط أساس.
قياس تركيز RNA وتعديله إلى ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر. تخطيط تخطيط لوحة PCR مع جدول بيانات مع الأخذ بعين الاعتبار كل من عينات الاختبار والتحكم. إعداد محطة عمل PCR عن طريق تطهير الأسطح وإذا كان استخدام مجلس الوزراء الأشعة فوق البنفسجية، بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية 10 دقيقة قبل بدء التشغيل.
إزالة الكواشف والنايات من الفريزر لذوبان الجليد ولكن الحفاظ على مزيج انزيم على الجليد في جميع الأوقات. خلط الكواشف والطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل. إعداد PCR الماجستير يمزج لفيروس ليسا وبيتا أكتين وفقا لاتجاهات المخطوطة.
اتركي المُمزجات الرئيسية على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام. خلط والطرد المركزي المُعدّة الرئيسية يمزج ويوزع 19 ميكرولترات في الآبار ذات الصلة من لوحة متوافقة مع الجهاز PCR أو شريط أنبوب. في غرفة منفصلة أو خزانة الأشعة فوق البنفسجية، بعناية إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المعدة.
في حالة استخدام خزانة الأشعة فوق البنفسجية، قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل 10 دقائق من بدء التشغيل. بعد نماذج الاختبار، أضف عنصر التحكم الإيجابي و لا يوجد عنصر تحكم قالب. عند إضافة الحمض النووي الريبي إلى الميكسات الرئيسية، تأكد من إضافته إلى البئر الصحيح.
استخدم خطة لوحة للمساعدة في هذه الخطوة. ختم لوحة التحقق من أن الأغطية مسطحة عبر لوحة وتدور عليه لجمع كل السوائل في الجزء السفلي من الآبار. ضمان كل بئر لديه نفس حجم السائل وليس فقاعات مرئية.
ثم نقل العينات إلى جهاز PCR. فتح البرنامج اختيار SYBR الأخضر مع الانفصام. حدد الآبار التي سيتم تحليلها باختيار غير معروف كنوع العينة وSYBR كصبغة فلورية.
تسمية الآبار على تخطيط لوحة مع معلومات عينة بما في ذلك ما إذا كان المقايسة هو لفيروس L أو بيتا أكتين. انقر على إعداد ملف تعريف الحرارة وعدّل ظروف الدراجات الحرارية كما هو محدد في المخطوطة. انقر فوق بدء ثم اختر موقع لحفظ الملف وحدد المربع لإيقاف المصباح في نهاية التشغيل.
عندما يظهر خيار البدء قبل أن يظهر الاحماء بالمصباح، انقر فوق تشغيل الآن ولكن تأكد من أن المصباح لديه أقل من 15 دقيقة للاحماء. عند اكتمال تشغيل PCR، تابع تحليل البيانات. أولاً، تحليل مخططات تضخيم فيروس ليسا.
تعرض العينات الموجبة سلالمًا أسية بينما تحتوي العينات السالبة على مخططات تضخيم مسطحة بدون قيم CT. بعد ذلك ، تحليل نتائج منحنى تفكك فيروس ليسا من عينات الاختبار جنبا إلى جنب مع عينات التحكم. عينة إيجابية فيروس ليسا سيكون لها درجة حرارة ذوبان بين 77 و 80 درجة مئوية وتداخل مع السيطرة الإيجابية.
بعد ذلك، تحليل بيتا Actin مخططات التضخيم ومنحنيات الانفصام مقارنة مع الضوابط لتفسير النتيجة الإجمالية. عرض التقرير النصي واستخدام التفاصيل لتسجيل قيم CT و TM التي تم الحصول عليها لعنصر التحكم RNA في بطاقة التحكم للتأكد من نجاح التشغيل وأنه يمكن الإعلام عن نتائج عينة الاختبار. ويستخدم هذا البروتوكول لإثبات حساسية من Pan-Lyssavirus RT-PCR على سلسلة تخفيف الحمض النووي الريبي من فيروس قياسي التحكم.
يشير منحنى التضخيم إلى أنه يمكن اكتشاف عدد قليل من 10 بيكوجرامات من فيروس ليسا، وتحقق منحنيات الانفصام من درجة حرارة ذوبان المنتج. يتم استخدام درجة حرارة الذوبان لتأكيد أن أمبيرليكون هو فيروس ليسا محدد. النتائج هنا تظهر مدى درجة حرارة الذوبان عبر جنس فيروس ليسا من 77.34 إلى 79.67 درجة مئوية.
وتعتبر قيم درجة الحرارة الذائبة التي تقل عن 76.8 أو فوق 80.2 غير محددة. يتم تحديد حساسية هذا اختبار RT-PCR أيضًا عن طريق الكشف عن الحمض النووي الريبي من ثلاث عينات من الدماغ الإيجابي لفيروس ليسا. ويمكن اكتشاف عدد قليل من 0.1 بيكوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستهدف لعينتين من العينات الثلاث.
وتجدر الإشارة إلى أن ممثلين من جميع أنواع فيروس ليسيسا المعترف بها يتم اكتشافها باستخدام هذا الفحص. إذا تحليل مستخلصات الحمض النووي الريبي من العينات السريرية مثل اللعاب أو CSF، قد تكون نتائج بيتا أكتين سلبية بسبب عدم وجود الأحماض النووية المضيفة. إضافة عنصر تحكم خارجية قد حل هذه المشكلة.
يوصى بتسلسل العينات الإيجابية لفيروس ليسا لتوفير معلومات إضافية حول الأصول الجغرافية والمضيفة لعدوى داء الكلب. يجب أن يكون التعامل مع فيروس ليسا إيجابية أو يشتبه في العينات الإيجابية وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية الصحة والسلامة. رنا المستخرجة غير المعدية، وبالتالي يمكن التعامل معها داخل مختبرات الاحتواء المنخفض.
