كمية فيروس داء الكلب في مختلف هياكل الدماغ البقري. والمكسيك بلد لديه إمكانات كبيرة في الثروة الحيوانية. وتحتوي الولايات التي لديها أعلى إنتاج للماشية على مناطق استوائية رطبة ومناطق جافة معرضة لخطر تفشي داء الكلب بسبب وجود خفاش مصاصي الدماء، ديمودوس روتوندوس، وهو المرسل الرئيسي لداء الكلب.
الكشف عن فيروس داء الكلب نيوكليوبروتين N الجين يستخدم في المقام الأول لتشخيص داء الكلب عن طريق الاختبارات الجزيئية. وباستخدام النهج القائمة على الفينول الخماسي الكلور، يمكن الكشف عن كميات ضئيلة من العوامل المعدية في عينة سريرية من خلال التضخيم الانتقائي والمتكرر لتسلسل النيوكليوتيدات الحمض النووي. ويستند qRT-PCR على الكشف عن وتكميم جزيء حيث تزداد إشارة الفلورسينس هي في نسبة مباشرة إلى كمية المنتج PCR في رد فعل واحد.
كما يزيد عدد نسخ من هدف الحمض النووي، وكذلك لا الفلورسينس. وبناء على ذلك، كان الهدف من الدراسة هو استخدام qRT-PCR الكمي لتحديد عدد الجسيمات الفيروسية في الهياكل التشريحية المختلفة للأدمغة البقرية، بعد الوفاة، بسبب عدوى داء الكلب. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي مباشرة من الأدمغة البقرية باستخدام طريقة استخراج عضوية وفقا للبروتوكول التالي.
استخدام 100 ملليغرام من أنسجة المخ من كل بنية تشريحية لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام كاشف المتاحة تجاريا تحتوي على ايزوثيوسيانات جوانيدينيوم. تجانس يدويا ما مجموعه 100 ملليغرام من الأنسجة من كل هيكل في ملليلتر واحد من كاشف ايزوثيوسيانات guanidinium عن طريق دوامة باستخدام المتجانس Dounce مع حشرات صغيرة داخل microtube لمدة 15 ثانية في أقصى سرعة. احتضان العينات على الجليد لمدة خمس دقائق، ومن ثم إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم.
اخلط العينات بقوة لمدة 15 ثانية. احتضان على الجليد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، ومن ثم الطرد المركزي في 12، 000 × ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب نظيف وإضافة 500 ميكرولتر من الكحول isopropyl.
احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في 21 درجة مئوية. طرد العينات في 12، 000 x ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. يستنشق العملاق المائي عن طريق الأنابيب.
الجيش الملكي النيبالي المعزول سيكون حاضرا كبيليه في الأنبوب. بعد ذلك، اغسل بيليه الحمض النووي الريبي مع ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 75٪ عن طريق الأنابيب والطرد المركزي عند 7، 500 × غرام لمدة خمس دقائق في درجة مئوية أربع درجات. Decant العملاقة والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي في درجة حرارة الغرفة، 21 درجة مئوية.
بعد ذلك، تمييع بيليه في 50 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي وجودته عند 260 نانومتر باستخدام مطياف. في المختبر النسخ يولد مرنا من الجين المستهدف.
استخدم زوج التمهيدي الذي يضخم الجين RABV N كاملة، واحد يستخدم كتحكم إيجابي في المقايسة QRT-PCR. تم تصميم هذه التمهيديات لتضخيم الجين الكامل RABV N، وإضافة المروج الذي يتعرف على البوليمر T7. لتضخيم الجين N RABV كله، استخدم التمهيديات عبر و RAB إلى الأمام والعكس، ومجموعة PCR عالية الدقة.
لكل رد فعل، وإعداد مزيج PCR الرئيسية بإضافة إلى عازلة رد فعل أنبوب PCR نظيفة مع 10 ميكرومولار من كل التمهيدي و 0.5 وحدة من البوليميراز عالية الدقة. لاستخدام منتج PCR كقالب لتركيب المختبر وإزالة مكونات التفاعل الأنزيمي ، قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة مكثفة قائمة على العمود ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ومن ثم قياس استخدام مطياف.
لتخليق الحمض النووي الريبي، استخدم عدة نسخ في المختبر مع خليط التفاعل التالي: خمسة ميكرولترات T7 النسخ 5X العازلة، 1.9 ميكرولتر من كل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات، 10 ميكروغرام من الحمض النووي RABV N المنقى، و 2.5 ميكرولتر من خليط الإنزيم. بعد ذلك، احتضان الخليط في درجة مئوية 37 لمدة أربع ساعات. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من وحدة واحدة لكل ميكروغرام Rnase خالية من DNase إلى خليط التفاعل واحتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية للقضاء على تلوث الحمض النووي.
تنقية الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر ومن ثم التركيز عليه باستخدام phenol:chloroform:isoamyl الكحول بنسبة 25:24:1. Resuspend بيليه الحمض النووي الريبي المنقى في 70 ميكرولتر من العازلة TE، ومن ثم تخزينه في 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. كرر بروتوكول PCR حتى يتم الحصول على ما يقرب من خمسة ميكروغرام من منتج PCR.
بعد تنقية وتركيز, في المختبر نسخ N الجينات مرنا سيكون حاضرا بتركيز 4.711 ميكروغرام لكل ميكرولتر. تأكد من أن الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر يتوافق مع جين N بعد الخطوة الخامسة من هذا البروتوكول ، واستخدم هذا كتحكم إيجابي في تفاعل سلسلة بوليمراز النسخ العكسي في الوقت الفعلي ، qRT-PCR. في الوقت الحقيقي عكس النسخ البوليميراز سلسلة من ردود الفعل، واستخدام نسخة مرنا في المختبر في ترميز الجين N كاملة كتحكم إيجابي.
جنبا إلى جنب مع مجموعة qRT-PCR التجارية من خطوة واحدة ، وذلك باستخدام تحقيقات التهجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام المسبار في التمهيديات التي وصفها كورونادو وزميل العمل 2010 للكشف عن منطقة محمية من RABV باستخدام ظروف الدراجات الحرارية التالية. تنفيذ التخفيفات التسلسلية من الحمض النووي الريبي في المختبر المنسوخ عن طريق الأنابيب بشكل متسلسل ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من مرنا في أنابيب حتى يتم الحصول على ستة مخففات فصل.
إعداد أنابيب في حجم 100 ميكرولتر في ثلاثة نسخ للاستخدام في خلق منحنى القياسية. إجراء qRT-PCR كما هو موضح سابقا. قم بإجراء qRT-PCR في دورة حرارية مع الدوار عن طريق معالجة عينات الدماغ المختلفة في وقت واحد مع ردود الفعل الجارية لإنشاء منحنى قياسي واستخدام ضوابط إيجابية ، وضوابط سلبية ، والمواد الخارقة المعزولة عن ثقافة الخلية.
لتقييم حد الكشف وفعالية الاختبار وحساسية الاختبار، استخدم منحنى قياسي في ثلاثية الظروف. للكشف عن الجين RABV N، استخدم الحمض النووي الريبي من عينات الحقل، والضوابط الإيجابية، والضوابط السلبية، والمواد الخارقة ثقافة الخلية لأداء qRT-PCR باستخدام عدة PCR وصفها سابقا. لتحديد عدد نسخ جينوم RABV الموجود في عينات الدماغ البقري ، احصل على بيانات CT من المنحنى القياسي والعينات البيولوجية ، ومن تلك المستوفاة من معادلة منحنى المعايرة يظهر هذا الرقم أنسجة الدماغ البقرية التي تظهر تلطيخا إيجابيا وفقا للمناعة المباشرة.
تظهر النتائج 100٪ 100٪83.3٪66٪ و50٪ إيجابية ل RABV في القشرة والمهاد والمدولة والمهور والقرن على التوالي. تؤكد هذه النتائج النتائج السابقة، وكانت ثلاثة على الأقل من الهياكل التي تم تشريحها من كل دماغ إيجابية ل RABV. ومن ناحية أخرى، تبين معادلة المنحنى القياسي العلاقة بين كمية المحتوى الوراثي ل RABV في العينة وحجم الجزء المضخم PCR.
تم استنتاج كمية المحتوى الوراثي ل RABV في النانوجرامات من خلال استيفاء قيم التصوير المقطعي المحوسب في منحنى المعايرة باستخدام المعادلة المعروضة في هذا الشكل. وباستخدام هذه المعادلة، وجد أن حد الكشف الذي يعادل 10 مرات إلى ميكروغرام خامس لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفيروسي يتوافق مع 36 نسخة من جينوم RABV. وتبين هذه النتائج أن المقايسة حساسة ويمكن استخدامها للكشف عن الفيروس في العينات التي تحتوي على عدد قليل من نسخ الجين RABV N.
تم حساب كفاءة المقايسة باستخدام منحدر المنحنى القياسي، الذي كان 3.28. وأظهرت العينات المستخدمة في QRT-PCR تضخيم الجين RABV N. ولتحديد عدد النسخ الفيروسية الموجودة، تم الحصول على قيم التصوير المقطعي المحوسب لكل عينة باستخدام معادلة منحنى المعايرة.
تم استبدال النتائج التي تم الحصول عليها في نانوغرام في الصيغة الموصوفة هنا. يعرض هذا الجدول النتائج المقارنة بين qRT-PCR و DFA. وكانت نتائج عمليات الفحص التي أجريت في مجال إعادة الإعمار ومكافحة الارتهان والمبارس متسقة مع نتائج الانتخابات التي تم الحصول عليها باستخدام نظام مكافحة الضرر الذي يحدث في المناطق المحيطة بالضرر.
ووفقا للنتائج التي تم الحصول عليها في اختبار qRT-PCR في الحالتين C و D، فإن المهاد هو الهيكل الذي يمتلك أكبر عدد من نسخ جين RABV N. وهذا يشير إلى أن العدوى المبكرة للخلايا العصبية تحت المهاد والثالامية مهمة في تطور المرض ، بالنظر إلى أن هذه الخلايا العصبية تتحكم في الوظائف النباتية للحيوان. أرقام النسخ من الجين RABV N التي تم الكشف عنها في كل هيكل من كل عينة هي: حساسية وخصوصية اختبار qRT-PCR نحن على حد سواء 100٪ كما كانت جميع العينات إيجابية.
وتتسق هذه النتيجة مع التشخيصات الأولية للعينات. qRT-PCR تقنية حساسة للغاية. بعض الخطوات حاسمة للحصول على أفضل النتائج.
واحدة من هذه هي التعامل السليم مع عينات لاستخراج الحمض النووي الريبي. وهذه الخطوة حاسمة لأن الحمض النووي الريبي يتدهور بسهولة وبالتالي يمكن أن تتأثر النتائج. النظر في الحفاظ على العينة في ظروف باردة، ما يقرب من أربع درجات مئوية خلال هذه العملية.
وبالإضافة إلى ذلك، النظر في أن يتم تنفيذ عدة جولات من تطبيق PCR على النحو المذكور في النسخ المختبري. يمكن أن يكشف فحص qRT-PCR الذي أجري في هذه الدراسة عن عدد قليل من 36.3 نسخة من جين RABV N لكل ملليغرام من الأنسجة. وشملت هياكل الدماغ الأكثر ملاءمة لqRT-PCR القشرة والمهاد.
ويستند ذلك إلى الملاحظات التي تفيد بأنه تم الكشف عن تركيزات أعلى لجين RABV N في هذه الهياكل، وأنه تبين أيضا أنها إيجابية باستخدام الاختبار المرجعي ل RABV. وتمكن الاختبار من اكتشاف تركيزات منخفضة جدا، 0.00023 مرة 10 إلى النسخ التاسعة من الفيروس في عينات مختلفة. وبالإضافة إلى تحديد كمية الجسيمات الفيروسية في العينة، يبدو أن الاختبار يوفر أداة تشخيص وبحث بديلة جيدة للكشف عن فيروس RABV المعروض هنا.
