يمكن استخدام هذا البروتوكول لتشخيص ما بعد الوفاة من داء الكلب الحيواني من العرض الأولي للوصم في الحقل إلى التشكل الجزيئي في مستوى مركزي من النشاط. يُذكر أنّ التشخيص المناعي السريع هو بديل مفيد للوسمات الريفية والريفية في أفريقيا وآسيا حيث لا تتوفر مواد مرجعية لتشخيص داء الكلب. إثبات الإجراء سيكون (سايمون بونس) فني من مختبري
ومن بين البينات الأولى من الإجراء إبراهيما ديكو، وهو من فريق العمل المركزي فيتيرينيير في باماكو، مالي. للوصول إلى ماغنوم الفقهات، استخدم سكينًا لإزالة رأس الحيوان قبل الفقرات العنقية الأولى. واستخدام أداة مناسبة لجمع عينة جذع الدماغ.
مثل ماصة يمكن التخلص منها، قش الشرب، المشبك، أو القطارة كما هو مبين هنا. ثم جذع الدماغ مرئيا بوضوح كما هو موضح هنا مع غيض من هذا الماصة. استخدام أداة مناسبة لجمع جزء من هذا الجذعية الدماغ مثل قش الشرب.
إدراجه بعناية وبدوره بلطف لجمع أنسجة الدماغ. لا تنسى أن سد القش بإصبعك قبل إزالته، من أجل جمع الخزعة. استخدام المشبك هو أيضا ممكن.
من أجل جمع أكبر قطعة من جذع الدماغ على مستوى ماغنوم الهدّان. بدلا من ذلك، فمن الممكن استخدام مباشرة القطارة المقدمة في مجموعة لجمع جذع الدماغ. وبالمثل إلى القش الشرب، إدراج القطارة بعناية أثناء الضغط وتتحول بلطف لجمع أنسجة الدماغ.
ثم تعرق أنسجة الدماغ ووضعها في وعاء مثل سدادة أنبوب. لتشخيص دقيق من المهم جمع الدماغ الذي يحتوي على النخاع ablongata، خلال جمع العينة. سحق بعناية المواد المخ مباشرة في أنبوب يحتوي على العازلة مع مسحة أو القطارة لمدة 30 ثانية حتى يتم الحصول على تعليق متجانسة.
باستخدام القطارة، إيداع أربع قطرات ما يقرب من 100 ميكرولترات من التعليق في مدخل العينة على جهاز الاختبار. في حالة التأخير بسبب تعليق اللزوجة العالية أو لتسريع بدء الهجرة ، خدش بلطف الجزء السفلي من موقع الإيداع للجهاز مع القطارة. انتظر ترحيل نموذج كامل، من دقيقة إلى خمس دقائق قبل قراءة جهاز الاختبار.
تعتبر العينة إيجابية لداء الكلب عندما يكون خطان مرئيين. سالب، إذا كان سطر التحكم موجوداً فقط. وغير صالح إذا كان خط الاختبار أو لا خطوط مرئية فقط.
لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينة جهاز، افتح الجهاز بعناية وقم بإزالة ورق التصفية. جمع منطقة إيداع العينة ووضع العينة في ملليلتر واحد من LS trireagent. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض اليدوي لطيف العادية، استخراج الجيش الملكي النيبالي من أنابيب فائقة وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية. إضافة اثنين microliters من الجليكوجين لتسهيل هطول الأمطار RNA وفقا لتوصيات المصنعين.
ضبط حجم النهائي من resuspension RNA إلى 50 ميكرولترات مع المياه الحرة النوى. وإعداد حل التفاعل مزيج ماجستير لـ ثلاثة نسخ عكسية مختلفة المقايسات PCR الكمية وفقا للجدول. استخدام ال التمهيديات والتحقيقات كما هو مبين في الجدول.
في خمس ميكرولترات من عينات الحمض النووي الريبي المخففة. و 15 ميكرولترات من مزيج ماجستير لكل من ثلاثة مقايسات مختلفة في مكررة في لوحات رد فعل جيد 96 المناسبة. إضافة الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لكل محك لكل لوحة في مكررة.
ثم تشغيل المقايسات المختلفة بعد ظروف ركوب الدراجات الحرارية كما هو مبين في الجدول. ويمكن تحليل النتائج كما هو موضح في الجدول. جمع خزعة الدماغ بسيطة قدر الإمكان لضمان جمع عينات عالية الجودة.
مقارنة مع تقنية مرجعية حساسية وخصوصية من التشخيص التشخيصي المناعي السريع كان عاليا في جميع المختبرات التي تستخدم هذه البروتوكولات. استناداً إلى العدد التراكمي للعينات المختبرة، كانت الحساسية العامة وخصوصية أكثر من 95٪ اختبار التشخيص المناعي السريع مناسب للكشف عن فيروس ليزا في خزعات الدماغ من الحيوانات المصابة. كما أن مستوى مستضدات فيروس ليزا مهم لتشخيص داء الكلب، ومع ذلك، فإن الحد من الكشف لا يزال مرتفعا عند اختبار تعليق الفيروس titrated.
في هذه النتائج التمثيلية، التي تم الحصول عليها بعد الكشف عن الحمض النووي الريبي بواسطة النسخ العكسي المزدوج panlisavirus العكسي استهداف PCR الكمية من البوليميراز الفيروسي لفيروس ليزا، تم إجراء لوحة من 51 الاختبارات التشخيصية المناعية السريعة الإيجابية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء جينوتيبينغ لأربعة عشر من العينات باستخدام PCR المُعَقَّقُة للهيمية التي تستهدف جينات النيوكليوبروتين الجزئية. التشخيص واستخراج لشريط الاختبار لgenotyping استناداً إلى بعد RT PCR أو بواسطة لتحليل سلسلة طويلة إضافية.
يمكن أن يوفر اختبار التشخيص المناعي السريع تشخيصًا سريعًا ودقيقًا لداء الكلب. وهو أمر حاسم للحفاظ على وظيفة الموجة في أنظمة المراقبة والتحكم القائمة على الموجة المستمرة. والتقليل من النسّان البشريّة.
