يصف البروتوكول لدينا طرق التعبير الفعال وتنقية مجال FAH الذي يحتوي على البروتينات ولكن أيضًا البروتينات بشكل عام. FHD البروتين-1 يلعب دورا تنظيميا في دورة TCA واستقلاب الطاقة من الميتوكوندريا. كنا قادرين على ربط FHD-1 downregulation إلى الشيخوخة الخلوية ومعلومات عن نشاط الانزيم وهيكل البروتين مطلوبة بشكل عام من أجل فهم الآليات الجزيئية وراء الأنماط الظاهرية الملاحظة.
والميزة الرئيسية للتعبير عن البروتينات عبر أنظمة ناقلات IPTG غير قابلة للانحلال هي أن جميع الطرق رخيصة نسبيًا وسهلة التركيب في أي مختبر. باستخدام بروتينات من نوع الهستيدين المتعددة بالاقتران مع راتنجات النيكل NTA agarose، يمكن استخدام الانتقائية الهائلة لخرونية التقارب بتكلفة منخفضة. لمعظم الأغراض، قد البروتين التي تم الحصول عليها في هذه النوعية بالفعل كافية.
FPLC على اليد الأخرى، هو أسلوب راسخ وعامة مع العديد من المزايا مقارنة مع أساليب أخرى. أولاً، أدخل خمسة إلى 10 نانوجرامات من البلازميد إلى 100 ميكرولترات من بكتيريا BL21-DE3 pLyss E.coli المختصة على الجليد. اضغط قليلا على الأنبوب من أجل خلط المحتويات.
إبقاء البكتيريا على الجليد لمدة 30 دقيقة، والنقر بلطف الأنبوب كل بضع دقائق. سخني شاكراً حرارياً إلى 42 درجة مئوية. وضع أنبوب يحتوي على البكتيريا في الجهاز والحرارة لمدة 90 ثانية.
ثم، ضع الأنبوب على الجليد على الفور. بعد خمس إلى 10 دقائق على الجليد، إضافة 600 ميكرولترات من المتوسط NZCYM ووضع الأنبوب في حاضنة البكتيريا. يهز أنبوب في سرعة متوسطة المنحى على طول اتجاه اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة، لوحة 200 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية على 10 سم LB agar لوحة تحتوي على المضادات الحيوية اختيار الاختيار. ثقافة البكتيريا على لوحة أجار LB في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد تكوين مستعمرة ناجحة، واختيار مستعمرة واحدة وتفريقه في خمسة ملليلتر من NZCYM مع المضادات الحيوية المختارة.
الثقافة في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد النمو البكتيري الناجح ، تضخيم البكتيريا في 250 ملليلتر ، 500 ملليلتر أو دفعات لتر واحد من المتوسطة اعتمادا على الطلب على كمية البروتين. ثم، ثقافة البكتيريا، في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.
بعد الحضانة، رسم عينة للتحليل الضوئي. إذا كانت الكثافة البصرية في 600 نانومتر قد وصلت إلى 0.4، وتطبيق 200 ميكرومولر تصل إلى ملليمتر واحد من ايزوبروبيل-بيتا-D-thiogalactopyranosid. بعد ثلاث إلى خمس ساعات أخرى في حاضنة البكتيريا في 37 درجة مئوية من التعبير البروتين استنفدت.
حصاد بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 5،000 مرات G لمدة خمس دقائق. ثم، والتخلص من افرط وتجميد بيليه في ناقص 20 درجة مئوية لتخزين وجيزة. لكل 250 ملليلتر من التعليق البكتيري الأصلي، وتطبيق خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المحدد إلى بيليه البكتيرية.
إضافة 10 ميكرولترات من بيتا ميركابتوتانول لكل خمسة ملليلتر من العازلة التطبيقية. استخدام 10 ملليلتر باستور pipet لفرض ميكانيكيا بيليه في التعليق عن طريق الخدش و pipetting. نقل كل من تعليق أنبوب 50 ملليلتر.
ثم سونيكات التعليق. بعد ذلك، جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة بسرعة عالية في أربع درجات مئوية. تصفية supernatant على التوالي مع وحدات التصفية على الجليد.
إعداد عمود من البلاستيك أو الزجاج فارغة عن طريق إرفاقه إلى التجنيب مستقرة وغسل مع النيكل NTA تشغيل العازلة. لكل 10 ملليلتر من تعليق البروتين تطبيق 500 ميكرولترات من النيكل NTA agarose الطين إلى العمود. ملء العمود تماما مع النيكل NTA تشغيل العازلة ضمان عدم تعطيل راتنج agarose والسماح للمخزن المؤقت لتشغيل من خلال الجاذبية.
بعد ذلك، تطبيق تعليق البروتين على العمود والسماح للعينة لتشغيل من خلال الجاذبية. بعد أن مرت العينة من خلال، تعبئة العمود مع النيكل NTA تشغيل المخزن المؤقت. وضع cuvette الأشعة فوق البنفسجية شفافة تحت العمود وجمع ملليلتر واحد من النيكل NTA العازلة elution.
تحقق من الكثافة البصرية للعينة عند 280 نانومتر مقابل عينة فارغة. على النحو الأمثل، يعرض العينة كثافة بصرية أكبر من 2.5. منذ البروتينات والنيكل NTA العازلة elution سوف تترسب عند تجميد وذوبان الجليد، dialyze البروتين ضد عازلة مختلفة بين عشية وضحاها على الجليد باستخدام ميكرولتر واحد من DTT لكل 100 ملليلتر من عازلة غسيل الكلى.
قم بإعداد نظام FPLC وغسل العمود بخمسة أعمدة من 20٪ إيثانول متبوعة بخمسة مجلدات أعمدة من الماء. بعد اكويفيرتينغ العمود، تطبيق نموذج dialyzed على العمود وجمع تدفق من خلال. إعداد elution تدرج.
بعد انتهاء التدرج، قم بتشغيل مع المخزن المؤقت الملح العالي حتى يتم الكشف عن المزيد من القمم عبر نطاق وحدة تخزين عمود واحد. بدء قارئ لوحة صغيرة وتككيل لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية. إعداد ملليلتر واحد من محلول 20 ملليمولار من الركيزة ليتم اختبارها في إنزيم تحليل مؤقت.
وفقا لمخطط الأنابيب في بروتوكول النص، وإعداد إنزيم فارغة وعينة الآبار عن طريق الأنابيب 90 ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت في الآبار مع خمسة ميكرولترات من محلول انزيم. ثم إعداد الركازة فارغة وعينة الآبار عن طريق الأنابيب 95 ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت في الآبار. الحق قبل القياس، وتطبيق خمسة ميكرولترات من إنزيم المخزن المؤقت لمخزن الآبار الفارغة الستة.
تطبيق خمسة ميكرولترات من محلول الركيزة 20 ملليمولار على آبار العينة. استخدام الأنابيب متعددة القنوات في 50 microliter الإعداد لخلط بلطف الآبار. ثم، أدخل اللوحة في قارئ اللوحة الدقيقة وقم بقياس كل بئر في 255 نانومتر.
وأخيراً، قم بإجراء التحليل في جدول بيانات. يتم تصوير مثالين لوحات LB agar بعد التحول الأمثل وغير الأمثل هنا. تشير العديد من المستعمرات البكتيرية إما إلى أن اثنين من البكتيريا كانت مطلية أو أن المضادات الحيوية قد تكون منتهية الصلاحية.
قد تشير بعض المستعمرات البكتيرية إلى أنه إما لم يتم استخدام ما يكفي من البلازميد للتحول أو أن الكثير من المضادات الحيوية استخدمت لتحديد البكتيريا. يتم حصاد الكريه البكتيرية التي تحتوي على البروتين المعبّر عنه بكميات مليغرام ويتم التحقق من التعبير عبر صفحة SDS. قد تحدث بعض المشاكل أثناء هذه العملية البسيطة، بما في ذلك البروتينات التي تشكل أجساماً شاملة أو البروتين الذي لا يتم التعبير عنه.
إذا تم استخدام العلامة له للإشارة إلى البروتين، اللونية تقارب مع النيكل NTA agarose هو وسيلة سهلة ورخيصة التقاط القضاء على غالبية الملوثات. إذا لم يتم استخدام علامة، قد مزيج من ترسيب كبريتات الأمونيوم والكروماتوغرافيا التبادلية المائية على التوالي فصل البروتين عن غالبية البروتينات الأخرى. ويفصل البروتين كذلك من بقايا التلوث عن طريق اللوني التبادل الأيوني تليها الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على بروتين نقي بما فيه الكفاية.
ولا توجد أي من الطرق الموصوفة من الصعب على وجه الخصوص. ولكن جميع الأساليب تتطلب التدريب. قد تفشل المحاولات الأولى ولكن التجارب ستنجح بعد بعض التعديلات الإضافية.
جميع الأساليب المعروضة هنا هي طرق عامة لتنقية البروتين. على الرغم من تخصصه في بروتينات فهد، فقد يتم تكييف البروتوكول مع أي بروتين يرغب في تنقيته. تم الحصول على الإنسان المؤتلف فهد-1 من خلال الطرق الموصوفة والهياكل عالية الدقة الأشعة السينية ساهمت بشكل كبير في فهمنا لـ FAHD-1 من خلال وظيفة تعمل على حد سواء، decarboxylase وهيدرولاز.
البكتيريا المستخدمة في هذا العمل هي سلالات السلامة وغير الخطرة. وتنطبق أدلة السلامة العامة على جميع المواد الكيميائية وينبغي معالجة أعمدة FPLC بعناية.
